IF41︱Molecular Cancer:东部战区总医院/南京大学团队发现circFIRRE促进骨肉瘤原位进展及肺转移的新机制

骨肉瘤（Osteosarcoma）是一种高度侵袭性的恶性骨肿瘤，多发于儿童和青少年。根据WHO统计，骨肉瘤每年的发病率约为百万分之4.8，恶性程度高，易出现骨转移和肺转移，预后较差。骨肉瘤的综合治疗在近30年来没有显著提高，尤其是转移性骨肉瘤死亡率居高不下，迫切需要探索骨肉瘤治疗的新分子机制和新靶点，以找到更有效的治疗靶标，提高患者的存活率。环状RNA（circRNA）被证实在多种肿瘤中有着极其重要的作用，但是其在骨肉瘤中的作用研究较少。

2022年8月19日，东部战区总医院骨科周光新团队和南京大学生命科学学院陈熹团队合作在国际知名期刊Molecular Cancer（IF=41.44）杂志，发表题为“Circular RNA circFIRRE drives osteosarcoma progression and metastasis through tumorigenic-angiogenic coupling”的研究成果。该论文揭示了骨肉瘤组织中异常高表达的circFIRRE，通过ceRNA作用模式竞争性结合miR-486-3p和miR-1225-5p，调控下游靶基因LUZP1，并且通过“致瘤-血管生成耦合（tumorigenic-angiogenic coupling）”促进骨肉瘤原位进展和肺转移的全新调控机制。

为了研究骨肉瘤进展中的的差异circRNAs，作者首先对4对骨肉瘤及其癌旁组织进行circRNA测序检测出骨肉瘤中异常表达的circRNAs（图1A）。在异常高表达的circRNAs中，作者挑选出显著性差异最大的5个circRNAs作为研究的候选circRNAs。在扩大样本的进一步筛选后，circFIRRE被标记为骨肉瘤中最显著上调的circRNA（图1B），且其异常表达在更大样本、组织样本以及细胞系中均得到验证（图1C-E）。紧接着，作者对circFIRRE的诸多特性进行验证，包括亚细胞定位（图1E-H）、环化位点验证（图1I）、稳定性验证（图1J-O）和排除基因组重排（图1P-Q）。这些实验证明在骨肉瘤中异常升高的circFIRRE具有典型的circRNA特性。

图1：circFIRRE的筛选及特性验证

紧接着作者将108例骨肉瘤患者队列分为circFIRRE高低表达组进行单/多因素Cox比例风险回归分析，结果显示circFIRRE高表达是骨肉瘤的危险因素，且与骨肉瘤的转移水平呈现明显正相关（图2C-D）。生存分析也证实circFIRRE高表达组的总生存期（Overall Survival，OS）和无病生存期（Disease Free Survival，DFS）显著差于低表达组（图2E-F）。由此作者提出猜想circFIRRE的高表达可能帮助骨肉瘤发展，尤其是促进转移。

图2：circFIRRE的临床队列研究

接着在体外验证中，利用shRNA敲降骨肉瘤中的circFIRRE，通过CCK-8、EdU、Transwell等实验结果显示circFIRRE表达降低后，骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力也降低；而过表达circFIRRE后，骨肉瘤的增殖、迁移和侵袭能力则上升（图3）。同时，我们发现利用磁珠分离的转移性人骨肉瘤组样本中的内皮细胞中circFIRRE表达水平明显高于为未转移组（图4A-B）。籍此我们推断骨肉瘤内皮细胞中circFIRRE有可能促进其血管生成并最终帮助骨肉瘤完成远处转移。因此在体外用siRNA对血管内皮细胞中的circFIRRE敲降，成管实验显示circFIRRE表达下调后，血管内皮细胞的成管能力也会下降（图4E-F）。主动脉环成血管实验和鸡胚尿囊膜实验在半体内和体内水平证明circFIRRE敲降确实会下调血管生成能力（图4G-H）。过表达circFIRRE则会上调血管内皮细胞的成管能力以及体内血管生成能力（图4I-L）。自此，circFIRRE在骨肉瘤中介导肿瘤细胞进展和血管生成的身份得到了确认。

图4：circFIRRE促进血管生成

作者接着向上挖掘骨肉瘤中circFIRRE转录本增高的原因。综合UCSC、PROMO、JASPAR三种算法的结果，转录因子YY1被筛选出作为circFIRRE异常高表达的调控因素之一（图5A）。TCGA数据库、转录组测序以及骨肉瘤样本和细胞系RT-qPCR的结果都显示骨肉瘤中YY1的高表达以及与circFIRRE的正相关性（图5B-D）。Luciferase实验也证明YY1能够与circFIRRE启动子直接结合（图5E-F）。通过上调或者下调YY1转录因子，circFIRRE的表达水平也会成比例的发生变化（图5G-L）。这些数据证明YY1转录因子结合导致了circFIRRE异常高表达。

图5：转录因子YY1调控circFIRRE表达

在circFIRRE下游作用的探究中，作者首先通过Ago2 pulldown实验确定定位于细胞质中的circFIRRE可作为miRNA海绵发挥作用（图6A-C）。接着，综合miRanda、RNAhybrid、Interactome、circbank和RegRNA2.0的计算结果，miR-486-3p和miR-1225-5p被筛选为circFIRRE作用的候选miRNA（图6D）。RT-qPCR和FISH实验发现miR-486-3p和miR-1225-5p在骨肉瘤组织中表达水平低于正常水平（图6E-G）且与circFIRRE表达水平呈负相关（图6H-I）。miRNA pulldown实验和luciferase实验证明了circFIRRE能够作为miRNA海绵与miR-486-3p和miR-1225-5p直接结合（图6L-P）。骨肉瘤细胞FISH实验进一步证实了circFIRRE和两miRNAs在细胞质中共定位。这些数据提示circFIRRE在骨肉瘤细胞质中通过特异性结合降低了miR-486-3p和miR-1225-5p的表达水平。

图6：circFIRRE海绵吸附miR-486-3p和miR-1225-5p

最后，作者探寻了miR-486-3p和miR-1225-5p下游的靶向基因。综合miRDB、TargetScan 和 RNAInter的计算结果结合骨肉瘤转录组测序的结果筛选出LUZP1为候选基因（图7A）。首先通过大样本表达验证证实LUZP1在骨肉瘤组织中高表达与miRNAs水平呈负相关，且与circFIRRE呈正相关（图7B-E）。功能实验证明了LUZP1可以调节骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，内皮细胞的增殖、成管和血管生成能力。Luciferase实验证明了miR-486-3p和miR-1225-5p能够与LUZP1的mRNA直接结合（图7F-G）。并且通过回复实验证明了circFIRRE调节骨肉瘤发展以及血管生成是通过miR-486-3p和miR-1225-5p调节LUZP1水平来达到（图7H-L）。

图7：circFIRRE通过miR-486-3p&miR-1225-5p/LUZP1轴调控骨肉瘤进展和血管生成

最终，在裸鼠上通过胫骨骨肉瘤原位模型以及骨肉瘤肺转移模型证明了circFIRRE通过竞争性结合miR-486-3p和miR-1225-5p上调LUZP1表达，促进骨肉瘤生长和肺转移。

图8：体内验证circFIRRE生物学功能及其调控轴

综上，作者通过高通量测序筛选出异常高表达的circFIRRE，使用生物信息学手段和体外体内实验预测并证明了骨肉瘤发展过程中转录因子YY1上调circFIRRE表达水平，后者作为miRNA海绵竞争性结合miR-486-3p和miR-1225-5p，使得二者靶基因LUZP1高表达，这种表达模式一方面在骨肉瘤细胞中促进了癌细胞的增殖、迁移和侵袭，另一方面则作用于内皮细胞促进其增殖和成管来生成新的血管，这二者相结合帮助骨肉瘤生长和转移的作用，作者将其描述为“致瘤-血管生成耦合（tumorigenic-angiogenic coupling）”。

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东部战区总医院骨科的周光新教授和南京大学生命科学学院的陈熹教授为本文共同通讯作者，南京大学医学院硕士研究生俞凌锋和东部战区总医院骨科的朱浩硕士为共同第一作者。