Moderna mRNA疗法研究中新技术运用--Digital Western案例分享

RNA药物治疗领域近年来取得了快速进展，特别是mRNA新冠疫苗带动了整个领域发展进步，更多mRNA疗法进入到临床试验阶段。美国Moderna公司作为mRNA疗法领域的领导者，在9月份研发日活动上，除了mRNA疫苗领域临床开发进展外，重点介绍了mRNA疗法作为酶替代疗法的概念验证和临床进展。目前在研临床I/II期mRNA疗法mRNA-3927用于治疗丙酸血症（Propionic acidemia，PA）。丙酸血症是一种线粒体酶丙酰辅酶A羧化酶(PCC)缺乏引起固有代谢紊乱，PCC由六个α(PCCA)和六个β(PCCB)亚基组成，采用双mRNA递送方式可帮助细胞在体内合成有活性的PCC酶。

作为mRNA酶替代疗法，需要在细胞内表达相关蛋白酶，在体外和体内实验中都需要准确定量细胞内蛋白质表达量和mRNA用量之间关系。现有的细胞内蛋白质表达定量检测技术如Western blot、ELISA、LC-MS等都有改进空间，全自动毛细管电泳Digital Western技术（Simple Western）作为细胞内蛋白质表达定量领域的创新性工具，被Moderna用于mRNA药物发现和临床前研究阶段，加速推进mRNA药物研发。

mRNA-3927疗法细胞和组织水平蛋白质定量

mRNA-3927临床前小鼠动物模型研究表明，双RNA疗法可恢复代谢功能。采用编码人类PCCA和PCCB的双mRNA组合，装载在可生物降解脂质纳米颗粒（LNP）中，在肝中可产生功能性PCC酶。

Digital Western分析检测患者来源成纤维细胞和人Hep3B细胞线粒体内蛋白质表达。患者成纤维细胞内双mRNA转染导致PCC酶活性和蛋白质亚基剂量依赖性增加。双mRNA编码蛋白质比单独mRNA具有更高的PCC酶活性，高出5-24倍。下图a-c是比较双RNA共转染与hPCCA或hPCCB mRNA单独转染数据。a和d图是酶活性评估，两种mRNA编码PCC蛋白亚基都有助于增加PCC活性，产生最高PCC酶活性的最佳摩尔比为1:1。b和c图是采用毛细管Digital Western定量检测患者成纤维细胞中PCCA和PCCB蛋白质表达。

本研究同时采用毛细管电泳Digital Western评估小鼠组织中氧化蛋白标志物表达变化，如肝脏、心脏和大脑中氧化标志物表达水平变化，如过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1(OGG1)和亲环蛋白D(CypD)。5个月和10个月大PA亚型和野生型小鼠对比研究，PA亚型小鼠的氧化蛋白标志物轻微改变（<1.5倍），从而导致较轻微的线粒体功能障碍。这些器官中线粒体基因组没有显著差异。

mRNA疗法改善Citrin缺乏症小鼠模型中代谢和行为异常

采用LNP递送hCitrin-mRNA到小鼠模型体内实验，采用Digital Western评估小鼠肝脏中Citrin蛋白表达水平。下图结果表明，静脉注射hCitrin-mRNA-LNP后，在小鼠肝脏中产生剂量依赖性hCitrin蛋白表达增加。

通过相关研究证明了在人类细胞系和citrin缺乏的小鼠模型上，hCitrin-mRNA-LNP疗法对citrin缺乏症 的治疗可能具有显著疗效。

Digital Western检测13个hABCB4-mRNA变体转染后hABCB4蛋白质表达

进行性家族性肝内胆汁淤积症3型（Progressive familial intrahepatic cholestasis type 3 ，PFIC3)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，由编码磷脂酰胆碱转运蛋白 (ABCB4/MDR3) 的 ABCB4 基因功能丧失变异引起。哈佛大学医学院和Moderna公司联合研究团队，采用系列hABCB4-mRNA变体在细胞模型和PFIC3小鼠模型上进行药理实验。为了提高mRNA表达hABCB4蛋白水平，采用密码子优化方法增强蛋白质表达已达到治疗目的。采用Moderna内部开发算法产生了13个独立的密码子优化的hABCB40mRNA变体（V1-V13），瞬时转染HEK293细胞后定量检测hABCB4蛋白表达水平。与WT序列相比，大多数优化hABCB4-mRNA变体导致蛋白质表达效率明显提高，hABCB4v6-mRNA变体具有最高蛋白表达和相关活性。靶向肝脏hABCB4-mRNA疗法可实现功能性hABCB4蛋白从头表达，并在培养细胞内和PFIC3小鼠肝脏中恢复磷脂转运，重复注射可挽救年轻Abcb4-/-小鼠的疾病表型。本研究临床前概念验证了mRNA治疗可作为PFIC3疾病潜在治疗途径。

全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术，将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB蛋白质可视化定性的优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用微量组织样本实现内源性蛋白质精准定量。

此技术已广泛被核酸药物领域领导者采用，如mRNA药物Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO药物Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA药物Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA领域MiNA Therapeutics和中美瑞康等，及其他各种RNA疗法公司。

参考文献：

1. https://investors.modernatx.com/news/default.aspx

2. Jiang, L., Park, JS., Yin, L. et al. Dual mRNA therapy restores metabolic function in long-term studies in mice with propionic acidemia. Nat Commun 11, 5339 (2020)

3. Jingsong Cao, Ding An, etc. mRNA Therapy Improves Metabolic and Behavioral Abnormalities in a Murine Model of Citrin Deficiency. Molecular Therapy Vol. 27 No 7 July 2019

4. Guangyan Wei, Jingsong Cao, etc. Synthetic human ABCB4 mRNA therapy rescues severe liver disease phenotype in a BALB/c.Abcb4-/- mouse model of PFIC3.Journal of Hepatology 2021 vol. 74 j 1416–1428