知识分享荟 | 细胞基因治疗系列

2022-09-22 18:58:54 苏州镁伽科技有限公司

细胞基因治疗从工艺技术角度可分为三个主要维度，基因相关的、载体相关的和细胞相关的。上一期我们分享了基因编辑技术，本期来聊一聊载体相关的内容。

1973年11月，PNAS上发表了一篇关于构建细菌质粒的文章，作者Dr.Cohen等人运用当时新发现的限制酶EcoRI切割双链 DNA 以产生短的重叠单链末端，并通过体外结合构建了新的质粒DNA^[1]，影响了整个生物学历史的分子克隆技术由此诞生。

经过了近半个世纪的发展，现在质粒的构建方法已发展到超过 37 种，依据克隆的原理不同，可将这些方法分为三大类：单链克隆（single strand overhang cloning）、同源重组（recombination cloning）和megaprimer克隆^[²^]。

三种克隆方法对比

本期推文主要介绍单链克隆的4种质粒构建方法，Ⅱ型酶酶切构建质粒、LIC、无缝克隆、Gibson组装。

Ⅱ型酶酶切构建质粒

Ⅱ型限制酶是一类分子质量较小的单体蛋白，识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg²⁺存在即可。Ⅱ型限制酶能够特异性识别四到六个核苷酸序列，并在识别区内的特定位点内切DNA双链中的磷酸二酯键，产生两个新的DNA片段，所形成的互补的DNA链通过DNA连接酶（通常是 T4 DNA 连接酶）连接形成环状质粒。

酶切法构建质粒是最基本且应用最广泛的一种方法，但也存在着很多缺点：如DNA 消化效率低下，不同种的限制性内切酶的活性不一致、DNA连接时间过长（37℃ 3h或16℃过夜）等。

LIC

发展至90年代，科学家们开发出了不依赖于连接的克隆（LIC，Ligation-independent cloning），LIC运用了T4 DNA聚合酶的核酸外切酶活性，在待插入片段以及线性载体的末端创造了约10-12个碱基的粘性末端，将载体和插入片段分别切割后进行退火处理，可形成含有4个切口的环状产物，转化后切口可通过同源序列在体外完成交换重组，达到基因克隆目的^[3]。

LIC是一种可靠的克隆方法，但由于其序列的局限性而受到限制。因为这10-12个碱基的突出末端不能包含反应体系中存在的dNTP，否则将在该位置发生聚合，阻止T4聚合酶将整个10-12个碱基都切除，因此，LIC仅可用于专门设计的质粒。

无缝克隆

无缝克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的，唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基^[4]。

通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化，进入宿主菌中的线性质粒依靠自身酶系将缺口修复。

Gibson组装

Gibson组装技术在2009年首次被Dr.Daniel和其同事提出，该技术也可以进行单个目的片段的插入^[5-6]。进行Gibson连接时首先需要获得末端含有同源区域的DNA片段，一般是通过PCR获得，然后这些片段和酶混合物在特定温度下保温即可完成连接。

酶混合物通常含有三种不同的酶：T5 DNA 外切核酸酶用以产生 3''-ss 突出端；Phusion DNA 聚合酶用来填补缺口；Taq酶用于 DNA 连接酶进行连接。

以上四种单链克隆的细胞质粒构建技术各有优劣，质粒构建的方法还需根据构建DAN重组体的目的、载体、试剂盒等多种因素进行选择。今天的分享到这里就结束啦，我们下期继续聊一聊细胞相关的基因治疗技术，敬请期待！

参考文献：

[1] S.C. Cohen, ACY, H.W. Boyer, R.B. Helling, Construction of biologically functional

bacterial plasmids in vitro, Proc. Nat Acad Sci. 70 (1973) 3240–3244.

[2] Li, XG, Evolution of plasmid-construction, International Journal of Biological Macromolecules 209 (2022) 1319–1326

[3] C. Li, R. Evans, Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 4165–4166.

[4] R. Benoit, R. Wilhelm, D. Scherer-Becker, C. Ostermeier, An improved method for fast, robust, and seamless integration of DNA fragments into multiple plasmids, Protein Express Purif. 45 (2006) 66–71.

[5] D. Gibson, G. Benders, C. Andrews-Pfannkoch, E. Denisova, H. Baden-Tillson, J. Zaveri, T. Stockwell, A. Brownley, D. Thomas, M. Algire, C. Merryman, L. Young, V. Noskov, J. Glass, J. Venter, C.R. Hutchison, H. Smith, Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome, Science 319 (2008) 1215–1220.

[6] D. Gibson, L. Young, R. Chuang, J. Venter, C.R. Hutchison, H. Smith, Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, Nat. Methods 6 (2009) 343–345.