Advanced Science：南京大学王守宇等团队发现胃癌潜在的预后生物标志物和化疗耐药治疗靶点

2022-09-20 10:40:05, 王强上海吉凯基因医学科技股份有限公司

胃癌（GC）是全球第五大最常见的恶性肿瘤和第三大癌症相关死亡原因，每年约有40%的新病例和死亡发生在中国。化疗是晚期胃癌患者的首选治疗策略。然而，耐药性和不可避免的严重毒副作用会导致化疗失败，预后不良。长链非编码 RNA (lncRNA) 在包括 GC 在内的多种癌症进展中起关键作用。

南京大学王守宇教授、孙倍成教授、中国药科大学莫然教授及中国科学院生物物理研究所薛愿超教授共同通讯在Advanced Science (IF=17.521)发表题为“APAF1-Binding Long Noncoding RNA Promotes Tumor Growth and Multidrug Resistance in Gastric Cancer by Blocking Apoptosome Assembly”的文章。

本文通过高通量筛选发现一种与凋亡蛋白酶激活因子1(APAF1)结合的 lncRNA (ABL)，ABL在GC组织中显著升高，并可以作为GC患者的独立预后因素。此外，ABL可以抑制GC细胞凋亡并促进GC细胞异种移植和类器官模型中的细胞存活和多药耐药。机制上，ABL通过直接与RNA结合蛋白IGF2BP1结合识别 METTL3介导的 ABL上的 m6A 修饰，维持ABL稳定性。同时，ABL可以与 APAF1的 WD1/WD2结构域结合，竞争性地阻止细胞色素C（Cyt c）与APAF1相互作用，阻断凋亡小体组装和 Caspase-9/3激活，最终导致GC细胞对化疗药物的多药耐药。总的来说，该研究结果表明 ABL可以作为 GC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

研究思路及方法

1. ABL表达升高与GC患者预后不良相关

作者首先以4例胃癌病人癌和癌旁组织进行lncRNAs表达谱的分析结合RNAscope、FISH染色等多个实验方法发现ABL的表达在GC组织中升高，且与 GC患者预后不良相关。

2. ABL直接与APAF1结合

随后，作者通过RNA Pull-down结合质谱分析，发现ABL与凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF1)结合。接着作者利用ABL antisense 探针进行dot blot实验，发现 ABL 在 481-540bp处与 APAF1结合；利用 RNA Pull-down 实验发现 ABL与APAF1 的WD1/WD2结构域直接结合。同时，LACE-seq实验证实APAF1可以与ABL结合。

3.抑制ABL表达促进GC细胞凋亡并增加GC细胞对化疗药物的敏感性

之后作者分别用不同浓度的顺铂（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）及紫杉醇（PTX）三种不同化疗药物处理ABL 稳定过表达/低表达的胃癌细胞，发现 ABL可以拮抗多种化疗药物的作用。

4. ABL通过竞争性阻断APAF1与Cyt c的结合来拮抗GC细胞凋亡

接着，作者通过 western blot、IF、流式、TUNEL等实验证实在外界凋亡信号如 DDP 等化疗药物刺激下， ABL可以竞争性结合APAF1，抑制Cyt c与 APAF1结合形成凋亡复合体，从而不能激活Caspase 9 形成 Caspase 9剪切体，减轻了Caspase级联反应，抑制Caspase 3的剪切，最终拮抗了DDP等药物诱导的GC细胞损伤及细胞凋亡。

5. ABL促进体内GC细胞生长和多药耐药

随后，作者利用DDP及PTX处理ABL稳定过表达的胃癌类器官，发现ABL可以拮抗DDP等化疗药物诱导的类器官细胞损伤及细胞凋亡。此外，小鼠体内成瘤实验也证实ABL促进体内GC细胞的生长和顺铂耐药。

6. IGF2BP1结合并识别ABL上m6A修饰而保持 ABL的稳定性

之后，作者通过多种实验方法证实 ABL 在 121–180bp处与 IGF2BP1结合；利用 RNA Pull-down 实验发现 ABL与IGF2BP1的 KH1/KH2结构域结合。过表达 RNA甲基化转移酶METTL3，则会增加ABL的m6A修饰，促进ABL的稳定。接着，作者通过双荧光素酶报告基因证实 IGF2BP1可以识别ABL（121–180bp）上的m6A修饰。总的来说，IGF2BP1结合并识别 ABL上 METTL3介导的 m6A修饰而维持ABL的稳定性。

7. ABL增强化疗药物对胃癌细胞的敏感性

最后，作者探索发现了一种新的靶向ABL的治疗策略，使用纳米材料共组装ABL siRNA和PTX，可以显著增强PTX在体内对GC细胞的杀伤作用，促进 PTX的抗肿瘤作用。

研究总结

该研究中鉴定了一个结APAF1的lncRNA (ABL，也称为 RP3-512B11.3) 并揭示了其在GC中的生物学功能。作者发现 IGF2BP1 直接结合并识别了 METTL3 介导的ABL上的m6A修饰从而维持 ABL稳定性，导致ABL表达上调。丰富的ABL可以通过直接与APAF1结合，竞争性阻断 APAF1与 Cyt c的相互作用，从而阻断凋亡小体的组装和Caspase-9/3 的激活，最终导致GC细胞对化疗药物的多药耐药。总的来说，该研究结果表明 ABL可以作为 GC潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

注：METTL3过表达慢病毒来自于吉凯基因。