胰腺导管腺癌如何演变？北大第一医院利用scRNA-seq探索PDAC异质性

胰腺导管腺癌 (PDAC) 在所有胃肠道肿瘤中最具侵袭性，其复杂的瘤内异质性和特殊的肿瘤微环境为制定有效的治疗策略带来了巨大挑战。2021年，来自北大第一医院的研究人员利用单细胞测序描绘了PDAC恶性进展过程中肿瘤微环境成分的动态变化。

为了分析 PDAC 恶性进展过程中肿瘤微环境的动态变化，单细胞 RNA-seq 对来自不同临床阶段的 PDAC 的 18555 个细胞进行测序（图 1A ），确定了 9 个不同的簇，包括导管细胞、巨噬细胞、B 细胞、内皮细胞、星状细胞、T 细胞、成纤维细胞、腺泡和内分泌细胞（图 1 B-D)。结果表明 PDAC I 中大多是导管细胞（44.88%），少数属于免疫细胞（17.06%），随着肿瘤分期进展，导管细胞数量逐渐减少（图1 H），免疫细胞比例增加逐渐（图1 I），反映了人体免疫系统对肿瘤病变的反应。

图1

导管细胞的亚群分析（共5800个细胞），表明不同肿瘤阶段的导管细胞形成了不同的簇（图 2B）。GO分析表明晚期PDAC（PDAC II和III）中上调的基因显着富集几个与癌症相关的术语，如细胞粘附、细胞因子活性、趋化因子受体结合、趋化因子活性和 R-SMAD 结合（图 2F ），早期 PDAC（PDAC I）中上调的基因主要与正常的生物学功能有关，包括核糖体的结构成分、细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合和 rRNA 结合（图 2G ），表明随着肿瘤发展，肿瘤细胞对细胞因子和趋化因子的反应能力增强。早期PDAC的导管细胞主要表现上皮细胞的表达特征，晚期富含间质标志物，并具有较高CSC相关基因的表达水平（图2H）。这些数据支持了上皮-间质转化和癌症干细胞特性随着肿瘤的发展而逐渐积累，促进了肿瘤的侵袭和转移的观点。

图2

对PDAC的2958个处在不同临床阶段的间充质细胞，进行亚群分析，根据特定的基因表达谱鉴定了三个亚群：cCAFs（经典CAFs）、csCAFs（分泌补体的CAFs）、PSC（胰岛星状细胞）（图3 A-C）。

PDAC III中的微环境仅包含一种间充质细胞（PSCs），不包含cCAFs和csCAFs。PSCs 在 PDAC I/II/III 中占主导地位，并表达高水平的 aSMA（图 3E-F）。

拟时序分析表明，树状结构以具有 LUM 和 FAP 特征基因的 cCAFs 开始，经过具有C3、C7、CFD特征基因的csCAF，以具有RGS5、ADIRF、NDUFA4L2、CRIP1和NOTCH3特征基因的PSCs结束（图 3G）。

图3

对PDAC 中的T细胞（1521个）进行的亚分群，形成了11个亚群（图 4A-C）：CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、Th1/2、Treg、细胞毒性T细胞、效应 T 细胞、记忆 T 细胞和衰竭 T 细胞。PDAC II/III 比 PDAC I 呈现更多毒性 T 细胞、效应 T 细胞和记忆 T 细胞，晚期 PDAC 中积累了更多的 Tregs 和耗尽的 T 细胞（图 4D-E）。接下来，作者专注于 PDAC 诊断和预后的两个重要特征基因：IL2RA、IL2RB与IL2RG共同构成高亲和力IL2受体，通过控制调节性T细胞（Tregs）参与免疫反应的调节。对TCGA数据库数据分析，发现IL2RA与经典Treg标志物CTLA4、FOXP3、TIGIT呈正相关 (图 4H-I)。另一个标志物DUSP4在Treg/耗尽的T细胞中表现出高度特异性的表达模式（图4H）。基于TCGA数据库的生存分析表明，DUSP4高表达患者的预后明显低于DUSP4低表达患者（图4I） 。

伪时间分析表明，树结构从naïveT细胞开始，经过效应 T 细胞最终到达Treg/耗尽T细胞（图 4J），表明T细胞状态从激活到抑制和耗竭转变。

图4

PDAC中包括了4 个不同的巨噬细胞亚群（图 5A-C ），分析表明，晚期 PDAC（PDAC III）比早期 PDAC（PDAC I 和 II）具有更多的 M1、M2 和 TAM（图 5D-E）。

对PDAC 中的B进行分群，形成了6个具有不同特征基因的亚群（图5G-I ）。结果表明 PDAC I 中没有 B 细胞浸润，而基于转录分析，PDAC III 中的 B 细胞与 PDAC II 中的 B 细胞显示出根本差异。因此，作者推测B细胞在PDAC恶性发展过程中逐渐渗透到肿瘤微环境中，并进化成具有独特基因表达谱和促肿瘤或抗肿瘤功能的不同亚群（图 5J）。

 图5

加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 用于描述 RNA 测序中基因之间的相关模式。作者从 cCAFs、csCAFs 和 PSCs 中随机挑选30-50 个细胞构建基因表达矩阵用于 WGCNA 分析，发现属于同一细胞类型的细胞被分配到一组（图6A），WGCNA识别出8个模块，模块间存在显着相关性（图6B-C），其中，棕色模块可以很好地代表亚群 csCAF（图 6D-E），主要富集于细胞外结构组织、血管发育的调节以及补体和凝血级联反应（图6F-G）。

图6

作者利用RNA 原位杂交和免疫荧光确定了 csCAF 位于 PDACI 和 II 中恶性导管细胞旁边的组织基质中（图 7A-B），且PDACI 比 PDACII 和 III 具有显着更多的 csCAF（图 7CD）。这表明 csCAFs 可能在 PDAC 微环境中发挥抑癌作用，并在肿瘤进展过程中逐渐减少。RT-qPCR检测，发现C3和C7表达水平随着肿瘤分期的增加呈下降趋势（图7E-F）。

图7