单细胞测序专题——血液篇

2022-08-31 18:51:24, Dr.TDD 上海吉凯基因医学科技股份有限公司



血液是流动在哺乳动物的血管和心脏中的一种红色不透明黏稠液体,主要由血浆、血细胞(红细胞、白细胞)和血小板组成。外周血是除骨髓之外的血液,其中的淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)参与机体的特异性免疫应答反应。许多疾病与外周血密切相关,包括急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病等,同时,血液中免疫细胞的类型及其占比的动态变化、免疫图谱等也可以反应包括三阴性乳腺癌等许多疾病在免疫疗法与化疗联合应用后的治疗效果。


本文对部分将单细胞测序技术应用于探索病原暴露后外周血PBMC中环境特异性的基因表达调控、新冠肺炎的免疫反应机制以及与季节性流感病毒的异同点、大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)中非白血病免疫系统的功能等相关文献进行导读,希望为大家的单细胞相关研究带来启发。


案例一

PBMC单细胞RNA测序揭示了病原暴露后广泛且环境特异性的基因表达调控


研究目的:通过单细胞RNA测序揭示病原暴露后外周血PBMC中广泛且环境特异性的基因表达调控

样本信息:120个个体(体外不同病原菌刺激3h/24h)的PBMC样本

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:约1300,000个细胞


结论:对120个纵向暴露于三种不同病原体的个体外周血单个核细胞(PBMC)进行单细胞RNA测序后发现,在影响基因如何影响基因表达(如eQTL)和共表达(即共表达QTL)的环境方面,细胞类型特异性是比病原体特异性更突出的因素。PBMC对病原菌刺激反应最强,71.4%受病原菌暴露影响基因表达的遗传变异体(即响应QTL)也影响基因之间的共表达。对CLEC12A基因的通路分析显示,细胞类型、暴露时间和基因背景依赖的共表达相互作用,在PBMC中暴露3小时后,干扰素(IFN)通路特异性富集。在系统性红斑狼疮中,通过计算机模拟分析,证实了IFN活性和CLEC12A共表达模式之间的遗传背景依赖关系,表明CLEC12A可能是一个IFN调节基因。


案例二

变应性鼻炎免疫治疗后的单细胞免疫分析揭示致病性T2细胞的功能抑制和克隆转化


研究目的:利用单细胞转录组测序研究舌下免疫治疗(SLIT)前后抗原特异性T细胞的作用及变化

样本信息:人外周血PBMC(启动SLIT前和启动后1年获得)

测序策略:10x平台,scRNAseq+TCRseq

捕获细胞数:102,037 个细胞


结论:SLIT后的抗原刺激培养导致T2和调节性T细胞克隆扩增,且多数CD4 T细胞在治疗前后保留CDR3区,提示SLIT产生抗原特异性克隆反应和分化。然而,SLIT可减少功能性克隆T2细胞的数目,增加表达肌球蛋白(MSC)、TGF-β和IL-2的转换型 T2细胞数目。轨迹分析提示,SLIT诱导T2转型细胞克隆分化为调节性T细胞,揭示了SLIT促进T2细胞间充质干细胞表达并抑制其功能的部分机制。MSC可能是变应性鼻炎的一个潜在的生物标志物。


案例三

CD8+T大颗粒淋巴细胞白血病中白血病和非白血病免疫系统的单细胞特征


研究目的:通过单细胞测序探索T-LGLL中非白血病免疫系统的功能

样本信息:外周血PBMC(11个T-LGLL样本+6个健康对照)

测序策略:10x平台,scRNAseq+TCR-seq

捕获细胞数:>150,000个细胞


结论:T细胞大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGLL)克隆型比健康的反应性克隆型具有更强的细胞毒性和耗竭。T-LGLL克隆型通过共刺激细胞-细胞相互作用、单核细胞分泌的促炎细胞因子和T-LGLL克隆分泌的IFNγ,比反应性克隆与非白血病免疫细胞表现出更活跃的细胞交流。除了白血病细胞库,T-LGLL中的非白血病T细胞库也比其他癌症和自身免疫性疾病更成熟、更具细胞毒性和克隆限制,72%的白血病T-LGLL克隆型与其非白血病库具有相同的T细胞受体,通过可能的共同靶抗原将白血病和非白血病库连接在一起。


案例四

围手术期外周血PBMC动态图谱

研究目的:利用单细胞RNAseq探索围手术期麻醉对免疫细胞的具体影响

样本信息:人PBMC样本(来自手术前/手术后0小时/24小时/48小时/全麻患者)

测序策略:10x平台,scRNAseq + TCR-seq

捕获细胞数:107,870个细胞


结论:麻醉0 h时,CD56 NK细胞簇数改变,24和48 h时单核细胞簇数增加。CD56 NK细胞的特征基因主要富集于Jak-STAT信号通路、细胞粘附分子(24 h)和碳代谢(48 h), CD14单核细胞与其他细胞的通讯在术后0和48 h大幅下降。大手术创伤患者血浆细胞数量显著增加,戊糖磷酸途径富集。浆细胞与其他细胞之间的通讯在手术严重程度和麻醉形式之间有所不同。与吸入麻醉相比,静脉麻醉引起细胞类型的主要变化,包括CD14单核细胞、浆细胞和MAIT细胞。对免疫细胞变化的保护将有利于麻醉/手术后的恢复。


案例五

单细胞转录组分析揭示中性粒细胞稳态和感染的异质性


研究目的:通过单细胞RNAseq确定中性粒细胞异质性和分化景观

样本信息:外周血(人)+骨髓、外周血、脾脏(小鼠)

测序策略:10x平台&BD平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:19,582个细胞


结论:8个中性粒细胞群体被定义为不同的分子特征。三个成熟的外周血中性粒细胞亚群来源于不同的成熟骨髓中性粒细胞亚群。在已知和未知转录因子的驱动下,中性粒细胞在转录过程中逐渐获得杀微生物的能力,反应了一种有效而平衡的中性粒细胞反应的精细调节机制。细菌感染重组了中性粒细胞群体的遗传结构,改变了亚群体和初级中性粒细胞之间的动态转变,以增强其功能,而不影响整体的异质性。


案例六

单细胞RNA测序揭示阿尔茨海默病的B细胞相关分子生物标志物


研究目的:利用单细胞测序探讨阿尔茨海默病(AD)患者PBMCs中细胞亚群的差异

样本信息:4例AD患者(2例早期,2例晚期)和2例正常对照的PBMC

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:46,244个细胞


结论:通过单细胞RNA-seq分析,发现AD患者血液中B细胞明显减少,通过流式分选,发现B细胞减少与患者的临床痴呆评分密切相关;在AD早期,B细胞耗竭加速并加重AD小鼠的认知功能障碍和Aβ负荷。随着疾病进展,B细胞中一些特异性上调和下调基因与AD密切相关;基于B细胞预测AD严重程度成为可能,这有助于识别临床AD进展。


案例七

遗传祖先影响特定细胞类型对病毒感染的响应


研究目的:利用单细胞测序探究不同遗传祖先的人群对于病毒感染的细胞特异性响应

样本信息:欧洲和非洲籍男性的外周血PBMC

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:255,731个细胞


结论:较高水平的欧洲血统与早期感染中I型干扰素途径活性增加相关,这预示着在以后的时间点病毒滴度降低。大量的群体相关变异是由基因祖先区分的精确表达数量性状基因座解释的。此外,在与新冠肺炎疾病严重程度相关的基因中,遗传祖先相关基因丰富,这表明早期免疫反应导致了多种病毒感染结果的祖先相关差异。


案例八

通过单细胞转录组分析评估性别和年龄对免疫细胞景观的影响


研究目的:利用单细胞测序探究性别和年龄对免疫系统的影响

样本信息:20例男女(包括年轻和老年)的外周血PBMC

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:174,684个细胞(39,828个年轻男性+43,552个年轻女性细胞+47,101个老年男性细胞+44,203个老年女性细胞)


结论:随着年龄增长,男女之间免疫细胞差异增大,T细胞和B细胞在女性中更显“活性”,相关的激活信号通路富集更加明显。女性血液循环中有更多的浆细胞和更强的BAFF/APRIL系统,这与更强的适应性免疫反应相一致。相比之下,男性血液中NK细胞的比例更高,某些促炎基因的表达更高。


案例九

外周血单个核细胞的单细胞测序揭示了新冠肺炎和流感患者的不同免疫应答情况


研究目的:利用单细胞测序探究新冠肺炎的免疫反应机制以及与季节性流感病毒的异同点

样本信息:不同疾病进程的新冠患者与流感患者的PBMC(3例健康人/2例甲型流感病毒IAV感染患者/5例COVID-19患者)

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:46,022个细胞


结论:COVID-19和IAV患者血浆细胞均增加,COVID-19患者XIAP相关因子1 (XAF1)-、肿瘤坏死因子(TNF)和fas诱导的T细胞凋亡。进一步分析发现,COVID-19 (STAT1和IRF3)与IAV (STAT3和NFκB)患者激活的信号通路不同,关键因子的表达存在显著差异。这些因素包括新冠肺炎患者中白细胞介素(IL)6R和IL6ST表达相对增加,但与IAV患者相比,IL-6浓度同样增加,支持临床观察到的COVID-19患者前炎症因子增加。


案例十

单细胞测序揭示可预测慢性髓系白血病中伊马替尼最初耐药的细胞群


研究目的:利用单细胞测序探索在慢性髓系白血病(CML)患者中靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)应答者和非应答者的分子差异

样本信息:四名处于不同治疗阶段的CML患者外周血PBMCs

测序策略:10x平台,单细胞测序(scRNA-seq)

捕获细胞数:41,723个细胞


结论:在伊马替尼不良应答者中,与应答者相比,患者特异性治疗前独特的干/祖细胞在外周血中富集。这些结果表明,某些慢性粒细胞白血病患者对TKIs的抵抗可能是固有的,而不是后天获得的,非肿瘤免疫细胞类型也可能在分散患者对TKIs的反应性方面发挥重要作用。



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1.实验技术干货

2.蛋白质组学研究

3.腺病毒简介及应用

4.临床基础研究思路解析    

5.组织特异性腺相关病毒

6.单细胞测序    

7.慢病毒实验操作指南

8.悬浮细胞专用病毒

9.靶点设计/数据库教程

10.测序技术研究与应用

11.非编码RNA研究技术与应用

12.腺相关病毒选择/应用    

13.表观遗传研究

14.文章解析

15.国自然课题设计思路解析

16.生物信息分析及工具      

17.外泌体研究    

18.肿瘤免疫研究

19.高分文章  

20.吉凯病毒神经方向应用案例 



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