如何选择寡聚核苷酸样品制备方案？

从生物基质中提取样品是所有生物分析的第一步。这一样品制备步骤必须有效地去除样品（如：血液、血浆、尿液和组织）中的干扰化合物并浓缩寡聚核苷酸分析物 。良好的样品制备程序必须简单，并尽可能提供最大的分析物回收率，同时消除所有干扰。因为所有其他非分析化合物也都会在 MS 检测中引起基质效应。

因此，我们将寡聚核苷酸样品制备过程中面临的挑战归纳如下：

寡聚核苷酸与血浆蛋白相互作用而造成的样品制备难题。数据显示，部分寡聚核苷酸与血浆蛋白的结合甚至可以达到70%~80%。

寡聚核苷酸暴露于与柱、容器和实验室玻璃器皿的非特异性结合。寡聚核苷酸的负电荷是它们与玻璃和塑料容器、移液器、针头和柱子中的正电荷结合的原因。

如何保护RNA寡聚核苷酸样品免于降解。RNA分析物可以被 RNase 破坏，因此，在实验过程中需要使用不含 RNase 的玻璃器皿、塑料器皿、仪器管和试剂。

对于寡核苷酸的样品制备，

Xccelerator总结的主要方法：

生物基质中的寡聚核苷酸与蛋白质高度相关。因此所有的提取方法都应该先解除这种联系。最简单的寡聚核苷酸样品制备技术是结合乙酸铵、甲醇或乙腈的蛋白沉淀。

尽管使用蛋白沉淀是比较容易操作的方法，但这种技术在寡聚核苷酸生物分析中却很少见。因为蛋白沉淀方法的回收率通常还是较差的（回收率在5%-10%）。样品制备过程中核苷酸的强蛋白质结合会导致共沉淀和寡聚核苷酸的显着损失。此外，蛋白沉淀方法在 ESI-MS 检测中也会导致显著的电离抑制以及低回收率。

蛋白酶 K 对结合蛋白质的消化作用，通过将蛋白质从生物样品中水解为氨基酸来去除蛋白质。一般来说，酶解技术的回收率较高。然而，蛋白酶 K 消化后还需要进行其他纯化步骤，最常见的是 LLE（液液萃取），从而使这种技术变得低效且费力。此外，蛋白酶 K 消化涉及较长的孵育时间，这将阻碍它们在临床前或临床研究中的应用。添加其他特定化合物可以提高消化过程的简单性并最大限度地缩短消化时间。

生物分析中一种流行的样品净化技术是 LLE。它的原理是基于不混溶溶剂之间的物质分配来实现萃取分离。通常的做法是将水样中的化合物萃取到与水不混溶的溶剂中。生物分析中常用的有机溶剂有甲基叔丁基醚 (MTBE)、乙酸乙酯、己烷和 1-氯丁烷 。该技术广泛用于寡聚核苷酸样品制备，且通常使用苯酚/氯仿的混合物并添加少量异戊醇 (<5%)。文献报道，用毒性较小的二氯甲烷代替了氯仿。在大多数情况下，由于溶剂组合，该方法萃取的特点是高回收率，甚至可以达到 80-90%。高浓度的弱酸苯酚有利于置换与寡聚核苷酸结合的血浆蛋白。混合物中氯仿/异戊醇的存在则有助于将寡聚核苷酸释放到水相中。此外，还增加了蛋白质的变性和沉淀。

尽管该方法通常会产生高回收率，但 LLE 的应用需要一些额外的净化步骤。水相通常含有苯酚残留物，这可能会在处理过程中产生色谱分析问题。然而，它可以很容易地通过用氯仿进行的另一种 LLE 提取来去除。用于寡聚核苷酸提取的 LLE 经常与其他技术结合使用，例如酶消化或 SPE。有时 LLE 只是复杂的样品制备过程中的步骤之一，组合方法可彻底清除寡聚核苷酸中的干扰物，但每个额外的净化步骤都可能导致回收率的损失。并且单个样品处理时长基本都在1~3小时之间。

SPE 被视为低压液相色谱的一种形式。该方法常常被用于从液体生物基质或环境基质中提取和浓缩分析物。在 ASOGN 的典型 SPE 程序中萃取时，样品被加载到带有固体吸附剂的 SPE 柱中，其中分析物被吸附，其他物质被洗掉。接下来，该分析物组分再从色谱柱中洗脱出来。

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