使用冷冻共聚焦显微镜定位活性循环核孔复合物（下）

为了评估冷冻EM网格和样本的质量，先创建一张相机概览图像。使用透射或反射显微模式，可以看到载网碳膜是否完整（图1）。

同时，可以判断有关细胞及其相对于网格方格的位置的信息。在随后的EM步骤中，只能评估网格方格中心附近的目的细胞。为了改善细胞的定位，可以在将细胞接种到载网碳膜上之前应用微排布技术^[3]。   

在下文中，基于未发表的图像（德国海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供）和《核孔的在细胞内的原位结构及其转换的快照》中的数据^[1]，详细解释了3D冷冻靶向过程。

有关载网碳膜完整性的信息，以及荧光样品在网格方格内合适的位置，有助于选择合适的FIB研磨位置（图2）。

在为FIB铣削选择相关位置后，在这些位置沿光轴创建一系列荧光图像以获得3D信息。与普通宽场系统相比，要是想提高z方向的分辨率，共聚焦显微镜是首选方法。通过激光逐点扫描样品，只记录荧光发射的聚焦信息。然后，将在不同z位置记录的2D图像组合成3D堆栈（图3）。

显微镜系统的轴向分辨率主要取决于所用物镜的开启角度（所谓的数值孔径）。由于商品化冷冻显微镜为方便使用者而使用空气物镜（不需要浸入，可能会影响样品的玻璃化状态），因此实际分辨率有限。xy的典型分辨率为200 nm，z的分辨率约为800 nm。

为了能够正确定位感兴趣的细胞位置，可以将校准珠子作为参考结构应用于样品，以便在3D中对齐和关联荧光和EM图像^[4]。

典型的珠子尺寸为1µm，完全呈球形，这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子，可以更清晰地观察到含有金属的微珠，从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择荧光发射光不同于实际目标结构的荧光发射光的珠子，以便能够更好地区分（图4）。

由于基准点在LM和SEM中都可见，因此它们的坐标可用于在两种模式之间转换旋转、平移和缩放等参数。然后，可以将共聚焦显微镜中标记的靶坐标转换为FIB铣削过程，以增加获得FIB薄片中具有感兴趣结构的概率。

然而，用于精确3D定位的商业软件解决方案尚未开发，但基于上述出版物（3D Correlation Toolbox），有一个开源解决方案可用。

使用3D Correlation Toolbox，可以加载共聚焦图像数据，标记靶和校准珠子，并自动确定其中心坐标。然后将定义的坐标标记投射到FIB图像上，以定义铣削的xyz坐标（图5）。   

为了将靶区域研磨成适当薄的体积，感兴趣结构的上方和下方各设定一个铣削窗口，如荧光信号投射到FIB图像上所示（图5）。然后施加镓离子束，并削除相应窗口中的材料。可以在一个EM网格上创建多个薄片，从而提高工作流的效率。

为了以分子分辨率获得样品的结构信息，使用冷冻透射电子显微镜对冷冻样品薄片进行成像。通过在薄片的SEM和TEM视图之间进行配准，可以根据薄片中包含的目标荧光信号确定倾斜序列采集区域。然后将成像的倾斜序列进行计算组合，以重建细胞内部的三维体积。通过对许多同类单个蛋白的结构信息进行平均（亚层析平均），可以获得更好的大分子解析结构。在图6中，图5所示的下薄片由冷冻ET成像。断层照片的分割结果显示了核膜与靶NUP位置。 

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