提高细胞成像分析成功率的十个小技巧,速度来领

2022-08-09 10:36:19, 安捷伦科技 安捷伦细胞分析事业部(BioTek)


无论是基础科研还是生物制药亦或是环境研究,基于细胞的分析方法已经成为了许多实验室重要的研究手段。特别是活细胞研究,相比于终点法其优势是显而易见的,可以实时的观测到细胞的行为动态,避免错过关键事件,帮助研究者进一步探究细胞在不同条件下的行为变化规律和潜在机制。

细胞分析可以提供直观而丰富的试验结果,但是其过程也面临着诸多的挑战,回忆一下,当你小心翼翼地对你精心呵护的细胞完成一系列操作之后,满怀期待的打开显微成像系统,对即将呈现在你眼前的美丽又可爱的细胞倩影满怀期待的时候,你是否


因为总是找不到细胞或者焦平面而急躁?

因为刚刚找到的视野又不见了而悔恨?

因为明明应该是眼角那一抹明媚的红色眼影怎么就变成了涂出眼眶的的一片大地色而不解?

因为前几个小时还神采奕奕的细胞突然就垮了而懊恼?

……

数不过来的烦恼让对酒当歌变成了蹉跎岁月


十个提升细胞成像分析成功率的小技巧送给你,如果关于活细胞成像你还有别的技巧欢迎留言,有礼相赠哦!

十个小技巧

1

样品制备


高品质的细胞样品是确保获得高质量图像的关键一步。


细胞收集

首先,收集细胞前应确认培养瓶或者培养皿中的细胞已达到足够的密度,注意使用合适的消化液消化细胞,避免影响细胞基本功能。在实验过程中执行严格的无菌操作以防止污染,避免外来颗粒或细胞碎片对影响图像质量。


条件优化

活细胞成像分析使用的荧光探针需要具有细胞膜透过性,以评估胞内的结构和功能。因此在进行正式实验之前,需要对荧光探针的浓度和孵育时间进行优化,确保孵育后细胞活力不受影响的同时,实验中仍然能够检测到合适的荧光信号强度。此外,还需要注意潜在的背景荧光,针对这一点,可以考虑在成像前加入洗涤步骤。以上这些方法有助于获得具有良好信噪比的活细胞图像。


而对于如免疫荧光等固定的细胞分析来讲,建议使用经过验证的固定、透化以及染色方案,包括添加封闭液防止非特异性结合,在必要时优化抗体浓度。


2

耗材使用注意事项


器皿底部厚度

用于显微镜观察的器皿底部厚度很重要,因为倒置显微镜是需要透过这个厚度来观察样品的。不同耗材有不同的底部厚度,一些常见的耗材底部厚度包括:

  • 玻璃盖玻片:0.17 mm

  • 常规塑料微孔板:0.5 mm

  • 低密度微孔板:1.0 mm


专为成像而开发的新型微孔板,其底部厚度更接近于盖玻片。当使用较低数值孔径(NA<0.7)物镜进行成像时,耗材底部厚度不会产生很大影响。然而,当使用高数值孔径(NA≥0.8)的空气镜时,即便厚度仅有几微米的变化也会导致图像降质。且图像质量会随耗材厚度的增加而变差。


根据耗材底部厚度调整校正环

长工作距离物镜可以兼容不同底部厚度的器皿,来进行活细胞成像观察。而这类物镜上会有一个校正环,通过调节校正环的位置就可以调节物镜内透镜组之间的距离,确保了无论使用哪种类型的器皿都能够精确对焦。所以成像前可以先检查物镜校正环位置是否正确,避免事倍功半。

物镜校正环


3

细胞数量优化


对于常规实验而言,可分析的细胞数量越多,其结果就越可靠。然而对于细胞成像来说并非如此。细胞接种数量过多,会导致细胞叠加生长,使细胞难以区分,不利于细胞计数以及进行其他评估。细胞接种数量过少,则会失去统计学意义,还会造成细胞亚群分析的偏离


实验的后续处理和培养过程中细胞的数量的变化也应纳入考虑范围,因为细胞增殖在实验的准备和进行过程中始终持续发生。


4

细胞类型


应用于成像实验的细胞类型是多种多样的,包括永生化细胞系、原代细胞和干细胞等。需要根据细胞类型选择合适的对焦方式和成像方式。


二维细胞层

在显微镜实验中使用的多数细胞是贴壁细胞或者半贴壁细胞;经过正确的处理,这些细胞会附着在孔板底部并形成二维(2D)细胞层,因为细胞在一个平面上,可利用成像仪的自动聚焦功能实现对焦。


悬浮细胞

悬浮细胞,例如红细胞和白细胞,也可以成像,但此类细胞缺乏附着于表面的能力,需要额外操作将细胞限制在器皿表面,实现单一焦平面聚焦。悬浮细胞成像可以使用带有盖玻片的显微镜载玻片,或者带盖玻片的血细胞计数器上,通过盖玻片限制细胞在轴向上移动,从而提供更好的图像清晰度。当使用微孔板时,也可以通过离心将细胞固定至板底。


组织和三维细胞结构

更复杂的生物学研究,需要对组织和三维(3D)细胞结构进行成像分析。和 2D 单层细胞实验相比,大小和形状的差异使得组织和 3D 细胞成像需要更先进的成像技术。组织样品通常会比显微镜物镜提供的视野大得多,尤其是在使用高倍物镜要求高分辨率的情况下,因此,组织成像可以使用有蒙太奇自动拼接功能,将多视野图像准确拼接成一张高分辨率大图用于分析。


3D 细胞结构由成百上千个细胞构成,这些细胞不仅在 X 轴和 Y 轴上延伸,也在 Z 轴上延伸。使用 Z 轴层切成像和叠加可以为具有挑战性的研究如 3D 细胞、类器官或者有一定厚度的样本分析提供完全聚焦视图,同时也增加了后续分析的准确度。


5

荧光基团和荧光通道的选择


激发和发射光谱

选择合适的荧光基团对于成像是至关重要的。荧光探针或蛋白的激发和发射光谱应与 LED 光源、激发和发射滤光片以及二向色镜相匹配,以确保获得满意的荧光信号。


斯托克斯位移(Stokes shift)

荧光基团的斯托克斯位移是一个需要考虑的重要变量,狭窄的斯托克斯位移会导致背景荧光过度,信噪比降低。所以如果需要多个荧光基团一起使用,则应该进行额外的优化。分子光谱往往很宽,激发和发射光谱都可能会发生重叠,导致一个荧光基团渗透到另一个的荧光通道。因此,当两种荧光基团在细胞内同一区域做共定位时,这一点要尤为注意。


6

选择合适的聚焦方式


明场自动对焦

图像自动对焦是自动化成像中最常采用的方法。无标记细胞分析的图像对焦需要使用明场或相差光路,因为无标记的细胞与背景之间的对比度有限,所以对样品进行适当照明很重要。


开始操作时,可以采用手动成像的方式,找到样本聚焦的 Z 轴高度,并将此值在软件中该器皿的条件内设定,以便在使用该器皿时,仪器会使用适当的垂直高度开始自动对焦过程,可以最大限度地减少对焦时间。


荧光成像对焦

使用荧光成像方法,可以通过荧光信号实现自动对焦。此种方法在许多情况下都可以提高对焦的简便性,但在个别情况下需要注意调整:对于较强的荧光信号,自动聚焦更容易找到合适的焦平面,减少每个样品的对焦时间;但相反,若是荧光基团的信号较弱背景信号较高则会降低图像内的对比度,并很有可能引起失焦。


在使用具有高数值孔径和有限景深的物镜时,还需要考虑到荧光基团在细胞中的定位。对核染色可以准备把焦平面定位在核上,但当使用第二个通道对位于质膜的荧光基团所发出的荧光进行成像时,由于这两个荧光基团处于稍有不同的焦平面上,图像有可能无法正确对焦。使用固定的Z轴偏移可以适应这种差异,并且可以容易地校正这种差异


固定对焦方式

最后,当样品在多个孔或视野的焦平面高度一致性时,或者仅需要对实验过程或细胞状态进行粗略观察时,可以使用固定对焦代替自动对焦,在尽可能短的处理时间内对所有样品进行成像。


7

图像采集(曝光)的设置


图像采集设置

合适的图像采集设置对于获得有意义、可量化的数据和可用于出版的图像是至关重要的。这些设置通常包括激发光强度、相机增益和积分时间。定性显微镜使用图像采集设置,以提供最佳的图像;定量数字显微镜调整曝光参数以便尽可能地利用相机的整个 bit 深度。


避免过度饱和

在一次实验中对整个孔板进行固定曝光成像时,尽可能使用阳性和阴性对照来进行曝光设置,有助于避免像素饱和,同时,持续曝光可以准确量化测试样品之间的荧光变化。由于过曝无法定量,动态范围的上限会被截断,相反地,如果参数设置得太低(通常为了隐藏“背景”荧光),数据又会在动态范围的下限被截断,并再次扭曲定量检测结果。


手动成像

手动成像也可以用于图像采集设置,将得到的最终参数转移到自动成像的步骤。如果测试孔之间,或样品对照孔之间的荧光发生变化,则自动曝光功能就不可使用,因为成像仪会试图通过相应的参数调整来补偿高/低信号。这将导致数据均化,并消除预期的检测窗口。如果只有单个样品需要分析,或者实际信号值之间的比较不是分析标准的一部分,那么自动曝光还是很实用的。


8

动态成像


实时追踪细胞变化的动态成像,相比终点法,能够捕捉到可能会被遗漏的重要细微差别。动态成像的另一个好处是通过时间延迟成像获得动态的视频,除了可以进行数值量化以为,还可以可视化预期的变化。然而,和所有成像实验一样,动态成像也必须遵循一定的指导方针,才能获得尽可能好的图像和数据。


在动力学实验中建议采用固定曝光。因为实验设计中尽可能希望量化样品在孵育期发生的变化,而采用固定曝光可以防止动态成像阶段的数据均化。如果预期信号值会减少,应使用阳性对照进行参数优化;如果预计信号值会增加,则应使用阴性对照。还要注意的是,避免过低的参数设置,以免使预期出现的信号变化超出线性范围。选用稳定的荧光基团,保证其在整个成像过程中对光漂白的敏感性较低。


9

像素的位移


像素偏移是指由于成像路径中的滤镜使光线发生偏移,导致在高分辨率 CCD 相机上检测到的图像发生移位。通常这是由于发射滤光片的厚度不均造成的,这也被称为滤光片楔形。在使用不同的荧光通道获得同一样品的两个或多个图像,然后叠加以同时观察来自多个荧光基团的荧光时,这种偏移就会出现问题。因为每个图像都会因每一个滤光片组中不同的楔形角度而发生位移,所以由不同荧光基团产生的图像将无法被准确地关联或组合起来。


校准程序(Calibration procedure)

纵使是再昂贵的物镜和滤光片也依然会存在一定的偏差,可以用校准程序来进行修正。对于自动化的数字显微镜,这一步通常是在 LED 和物镜校准时完成的。使用明场作为照明参考,通过测定光圈中心即可测得每组 LED 和物镜的像素偏移。然后计算出每个像素的像素偏移用来调整图像,使多个通道图像可叠加在适当的位置。


通道转换工具(The channel shift tool)

一些数字显微镜软件可以在成像后使用通道转换工具来对多色图像中的单个颜色进行重新定位。举例来讲,在单独的荧光彩色成像步骤中移动的活细胞样品,可能会导致重叠图像与不同颜色发生轻微错位。这是由于不同颜色的通道是按顺序成像的,而在成像与可捕捉样品运动之间存在一个很短的时间间隔,通道转换工具使得研究人员可以重新定位通道来进行校正。


10

创造有利的环境条件


温度控制

活细胞的长期动态成像通常需要对环境条件进行一定程度的控制,以维持样品的活性。温度是一个主要考虑因素。虽然大多数哺乳动物细胞的生长条件是 37℃ ,但如果要使用细菌或酵母细胞,可能需要更高或者更低的温度。进行手动预设置或者在实验程序中添加温度控制的步骤,可以确保在成像时保持样本在适当的温度。


气体控制

气体控制也很关键。例如,使成像仓内保持 5% 的二氧化碳浓度,可为哺乳动物细胞提供合适的气体环境。在进行低氧诱导时,则需要设置合适的氧气浓度。


温度和气体控制装置可以为活细胞动态监测提供正确的温度和气体条件,避免在长时间的动态成像过程中牺牲样本的完整性。


以上十个 Tips ,你 get 到了吗?

如果你现在还没有找到合适的活细胞成像平台,那么你可以了解下安捷伦 BioTek 微孔板成像检测系统,该系统集多功能微孔板检测和多功能活细胞全自动显微成像于一体。在细胞增殖,细胞运动,细胞遗传毒性检测,细胞免疫反应,病毒疫苗研发,3D 细胞培养、类器官药敏检测以及模式生物如斑马鱼研究方面均有优秀的表现。该系统具有成像质量高、环境监控严格、自动化操作、高通量智能化分析等特点,可安全、灵活的完成各类基于活细胞的检测分析,无论是简单的细胞拍摄还是长达数周的细胞培养观测均能胜任。

Cytation 微孔板细胞成像系统介绍请戳



关于 BioTek

BioTek 是世界领先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司,拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果,配合友好强大的操作软件,为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学,促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司,成为细胞分析事业部的重要组成成员。


关于安捷伦

安捷伦科技有限公司(纽约证交所:A)是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者,致力于为提高生活质量提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2020 财年,安捷伦的营业收入为 53.4 亿美元,全球员工数为 16,400 人。


长按识别二维码,关注安捷伦细胞分析


  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018
  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018

Copyright ©2007-2022 ANTPEDIA, All Rights Reserved