提高细胞成像分析成功率的十个小技巧，速度来领

细胞分析可以提供直观而丰富的试验结果，但是其过程也面临着诸多的挑战，回忆一下，当你小心翼翼地对你精心呵护的细胞完成一系列操作之后，满怀期待的打开显微成像系统，对即将呈现在你眼前的美丽又可爱的细胞倩影满怀期待的时候，你是否

高品质的细胞样品是确保获得高质量图像的关键一步。

首先，收集细胞前应确认培养瓶或者培养皿中的细胞已达到足够的密度，注意使用合适的消化液消化细胞，避免影响细胞基本功能。在实验过程中执行严格的无菌操作以防止污染，避免外来颗粒或细胞碎片对影响图像质量。

用于显微镜观察的器皿底部厚度很重要，因为倒置显微镜是需要透过这个厚度来观察样品的。不同耗材有不同的底部厚度，一些常见的耗材底部厚度包括：

• 玻璃盖玻片：0.17 mm

• 常规塑料微孔板：0.5 mm

• 低密度微孔板：1.0 mm

专为成像而开发的新型微孔板，其底部厚度更接近于盖玻片。当使用较低数值孔径（NA<0.7）物镜进行成像时，耗材底部厚度不会产生很大影响。然而，当使用高数值孔径（NA≥0.8）的空气镜时，即便厚度仅有几微米的变化也会导致图像降质。且图像质量会随耗材厚度的增加而变差。

长工作距离物镜可以兼容不同底部厚度的器皿，来进行活细胞成像观察。而这类物镜上会有一个校正环，通过调节校正环的位置就可以调节物镜内透镜组之间的距离，确保了无论使用哪种类型的器皿都能够精确对焦。所以成像前可以先检查物镜校正环位置是否正确，避免事倍功半。

物镜校正环

应用于成像实验的细胞类型是多种多样的，包括永生化细胞系、原代细胞和干细胞等。需要根据细胞类型选择合适的对焦方式和成像方式。

在显微镜实验中使用的多数细胞是贴壁细胞或者半贴壁细胞；经过正确的处理，这些细胞会附着在孔板底部并形成二维（2D）细胞层，因为细胞在一个平面上，可利用成像仪的自动聚焦功能实现对焦。

悬浮细胞，例如红细胞和白细胞，也可以成像，但此类细胞缺乏附着于表面的能力，需要额外操作将细胞限制在器皿表面，实现单一焦平面聚焦。悬浮细胞成像可以使用带有盖玻片的显微镜载玻片，或者带盖玻片的血细胞计数器上，通过盖玻片限制细胞在轴向上移动，从而提供更好的图像清晰度。当使用微孔板时，也可以通过离心将细胞固定至板底。

选择合适的荧光基团对于成像是至关重要的。荧光探针或蛋白的激发和发射光谱应与 LED 光源、激发和发射滤光片以及二向色镜相匹配，以确保获得满意的荧光信号。

荧光基团的斯托克斯位移是一个需要考虑的重要变量，狭窄的斯托克斯位移会导致背景荧光过度，信噪比降低。所以如果需要多个荧光基团一起使用，则应该进行额外的优化。分子光谱往往很宽，激发和发射光谱都可能会发生重叠，导致一个荧光基团渗透到另一个的荧光通道。因此，当两种荧光基团在细胞内同一区域做共定位时，这一点要尤为注意。

最后，当样品在多个孔或视野的焦平面高度一致性时，或者仅需要对实验过程或细胞状态进行粗略观察时，可以使用固定对焦代替自动对焦，在尽可能短的处理时间内对所有样品进行成像。

合适的图像采集设置对于获得有意义、可量化的数据和可用于出版的图像是至关重要的。这些设置通常包括激发光强度、相机增益和积分时间。定性显微镜使用图像采集设置，以提供最佳的图像；定量数字显微镜调整曝光参数以便尽可能地利用相机的整个 bit 深度。

在一次实验中对整个孔板进行固定曝光成像时，尽可能使用阳性和阴性对照来进行曝光设置，有助于避免像素饱和，同时，持续曝光可以准确量化测试样品之间的荧光变化。由于过曝无法定量，动态范围的上限会被截断，相反地，如果参数设置得太低（通常为了隐藏“背景”荧光），数据又会在动态范围的下限被截断，并再次扭曲定量检测结果。

手动成像也可以用于图像采集设置，将得到的最终参数转移到自动成像的步骤。如果测试孔之间，或样品对照孔之间的荧光发生变化，则自动曝光功能就不可使用，因为成像仪会试图通过相应的参数调整来补偿高/低信号。这将导致数据均化，并消除预期的检测窗口。如果只有单个样品需要分析，或者实际信号值之间的比较不是分析标准的一部分，那么自动曝光还是很实用的。

像素偏移是指由于成像路径中的滤镜使光线发生偏移，导致在高分辨率 CCD 相机上检测到的图像发生移位。通常这是由于发射滤光片的厚度不均造成的，这也被称为滤光片楔形。在使用不同的荧光通道获得同一样品的两个或多个图像，然后叠加以同时观察来自多个荧光基团的荧光时，这种偏移就会出现问题。因为每个图像都会因每一个滤光片组中不同的楔形角度而发生位移，所以由不同荧光基团产生的图像将无法被准确地关联或组合起来。

纵使是再昂贵的物镜和滤光片也依然会存在一定的偏差，可以用校准程序来进行修正。对于自动化的数字显微镜，这一步通常是在 LED 和物镜校准时完成的。使用明场作为照明参考，通过测定光圈中心即可测得每组 LED 和物镜的像素偏移。然后计算出每个像素的像素偏移用来调整图像，使多个通道图像可叠加在适当的位置。

一些数字显微镜软件可以在成像后使用通道转换工具来对多色图像中的单个颜色进行重新定位。举例来讲，在单独的荧光彩色成像步骤中移动的活细胞样品，可能会导致重叠图像与不同颜色发生轻微错位。这是由于不同颜色的通道是按顺序成像的，而在成像与可捕捉样品运动之间存在一个很短的时间间隔，通道转换工具使得研究人员可以重新定位通道来进行校正。

活细胞的长期动态成像通常需要对环境条件进行一定程度的控制，以维持样品的活性。温度是一个主要考虑因素。虽然大多数哺乳动物细胞的生长条件是 37℃ ，但如果要使用细菌或酵母细胞，可能需要更高或者更低的温度。进行手动预设置或者在实验程序中添加温度控制的步骤，可以确保在成像时保持样本在适当的温度。

如果你现在还没有找到合适的活细胞成像平台，那么你可以了解下安捷伦 BioTek 微孔板成像检测系统，该系统集多功能微孔板检测和多功能活细胞全自动显微成像于一体。在细胞增殖，细胞运动，细胞遗传毒性检测，细胞免疫反应，病毒疫苗研发，3D 细胞培养、类器官药敏检测以及模式生物如斑马鱼研究方面均有优秀的表现。该系统具有成像质量高、环境监控严格、自动化操作、高通量智能化分析等特点，可安全、灵活的完成各类基于活细胞的检测分析，无论是简单的细胞拍摄还是长达数周的细胞培养观测均能胜任。

Cytation 微孔板细胞成像系统介绍请戳

关于 BioTek

BioTek 是世界领先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司，拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果，配合友好强大的操作软件，为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学，促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司，成为细胞分析事业部的重要组成成员。

关于安捷伦

安捷伦科技有限公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，致力于为提高生活质量提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2020 财年，安捷伦的营业收入为 53.4 亿美元，全球员工数为 16,400 人。

长按识别二维码，关注安捷伦细胞分析