【应用文章】针对皮肤填充剂应用评估透明质酸水凝胶流变学性质

透明质酸 (HA) 是一种天然的多糖，通常在许多局部和皮下抗衰治疗（如皮肤填充剂，利用多糖特有的粘性有效扩充软组织）中用作功能性成分。 皮下给药时，HA 在皱纹和细纹下方建立弹性网络，让皮肤看起来饱满细致。 天然 HA 的半衰期小于三天。所以，要开发出具有更佳临床持久性和可接受的保质期的产品，必须提高聚合物的持久性。 增加聚合物的分子量 (MW) 和交联程度是改善机械强度和延长降解时间的成熟策略。 但是，这些特征也会影响 HA 的其他性质，如粘度和粘弹性。

要成功配制 HA，必须了解分子量、分子结构、浓度和交联程度等因素对于粘弹性（直接决定产品性能）等流变学特征的影响。 通过流变学性质将结构特征与产品性能关联起来，可实现智能、快速和有效的配制。

以下研究显示了如何使用流变学和粒度测量表征 HA 皮下填充剂的物理性质。

图 1.  注射器内的 HA 皮下填充剂                实验

分别使用旋转流变仪和激光衍射法对三种市售 HA 皮下填充剂进行评估，表征其流变学特点和粒度。

使用 Kinexus 旋转流变仪（带 Peltier 温控板）并使用 40mm 平行板测量系统进行旋转流变仪测量。 各项流变性测量均在 25°C 下进行。

采用标准加载顺序，以确保两种样本都遵从一种一致且可控的加载方案。

包含不同幅度和不同频率测试的震荡测试。 执行频率为 1 Hz 的振幅扫描测试，以确定线性粘弹性区域 (LVER) 和临界应变。 然后使用 LVER 内的恒定应变在 0.1-10Hz 之间执行频率扫描测试。

执行稳态剪切测量，以检查不同剪切率 (0.1 s-1 - 100 s-1) 下的粘度依赖性，同时执行应力斜坡测试 (0Pa - 200Pa / 100s)，以确定填充剂的屈服应力。

在流变仪上使用轴向测试（快速将间隙从 1 mm 更改为 20 mm，然后记录正常力度曲线）评估填充剂的粘着性。 粘性与峰值法向力（测量单位为牛顿）相关联。

使用 Mastersizer 3000 对皮肤填充剂中的凝胶粒子进行了粒度测量。 将填充剂分散在盐水中，确定中位粒度和粒度分布情况。

结果与讨论振荡测试

弹性模量曲线是剪切应变函数，显示在图 2 中。 所有样品均具有相似的粒径 LVER 区域，其临界应变表示该区域中出现 20% 的非线性率。 在 LVER 内测得的弹性模量数值显示，样品 A 具有最低的弹性硬度，G’ 值为 150 Pa。 样品 C 是三种样品中弹性硬度最高的，G’ 值为 320Pa，样品 B 位居其中，G’ 值为 220Pa。

图 2.  显示弹性模量 (G’) 的幅度扫描数据（作为剪切应变函数）                

弹性模量和相位角曲线是振荡频率函数，显示在图 3 中。 全频范围内所有样品的相位角约为 10°，表示所有样品都是高弹性凝胶。 1Hz 下样品 A、B 和 C 的 G’ 值分别约为 150Pa、220Pa 和 320Pa，与相同频率下的幅度扫描数据相关。 G’ 值斜率随频率变化而稍有变化，表示小量结构弛豫（储存弹性能量）随时间增加（频率减小）而消散，虽然该变化相对而言很小。

图 3.  显示弹性模量 (G’) 和相位角 (δ) 的频率扫描数据（作为频率函数）                

许多因素会影响 HA 皮肤填充剂的粘弹性，包括 HA 浓度、分子量和交联程度。 通过改变这些特性，可对粘弹性（特别是弹性模量 G’）进行设计，以用于特定应用。 G’ 值较高的凝胶可提供较高的变形阻力，作为填充剂应该更为有效，但注射难度更高，疼痛程度也可能更大。 因此，G’ 值较高的强凝胶可能更适用于较深或严重程度较高的皱纹。 另一方面，G’ 值较低的弱凝胶可能更适合唇部或泪槽附近更为敏感的细纹或浅皱纹，因为这类凝胶的注射疼痛感较小。 较低的模量也可能与局部组织的性质更为匹配。 在进行的三次 HA 样品测试中，根据图 2 和 3 的所示结果，可以认为样品 A 是最弱且最软的凝胶，而样品 C 是最硬且最强的凝胶。

稳态剪切测试和屈服应力测定

稳态剪切测量结果 - 测得的剪切粘度是剪切率的函数，显示在图 4 中。 粘度随剪切率的增加显著减小，表示材料具有高度剪切稀化性质。 同时，填充剂结构很结实，在低剪切率下，粘度很高，而且会随着剪切率的降低继续升高，表示在静息状态下具有屈服应力或固体样特性。 这与震荡测试中观察到的结果一致，显示了高度弹性凝胶样结构。 屈服应力表示该材料在临界应力之下具有固体样特性，但在临界应力之上则可以像液体一样流动。 屈服应力的量级应与结构强度相关，因此，也与凝胶粒子的交联程度和浓度（通过 G’ 值体现）相关。

可使用一系列不同的测试测定屈服应力，但是，应力斜坡是最快和最简单的屈服应力估算方法之一。在这种方法中，将在剪切应力逐渐增加的情况下持续测量瞬时粘度（非稳态）。 三种 HA 样品的应力斜坡数据显示在图 6 中。 粘度峰值表示屈服点，该处应力值即为屈服应力。 样品 A 的屈服应力最低 (42Pa)，而样品 C 最高 (55Pa)，样品 B 稍低于 C (53Pa)。 这一顺序与震荡测试中观察到的结果一样，在三种凝胶中，样品 C 最强，样品 A 最弱。 由于这些凝胶多以共价交联凝胶粒子的集合形式存在（与连续凝胶网络相反），所以屈服应力取决于“拆分”粒子并让其相互移动所需的应力。

图 4.  显示稳态剪切粘度 (η) 的流变曲线（作为剪切率函数）                 图5.  显示瞬时剪切粘度 (η) 的应力斜坡数据（作为剪切应力函数）                 粘度测试

法向力曲线（时间函数，随板间间隙增加而变化）显示在图 6 中。 法向力数值为负数，这是由于上方测试板上的样品受到下拉的粘合/粘着力作用，逐渐减少为零直至应力消失；长时间的残余力来自上方测试板上剩余样品的重量。 样本 A、B 和 C 的峰值法向力分别为 0.35 N、0.46 N 和 0.54N，再次与三种样品的 G’ 值顺序和屈服应力测量值的结果相一致。 因此，样品 C 具有最高程度的粘性或粘着力，而样品 A 最低。

图6.  显示法向力曲线的粘性测试数据（作为拉开测试中的时间函数）                 颗粒粒度

需要控制凝胶粒子的粒度以减少注射凝胶过程中的挤压力和相关副作用（如疼痛和出血）。 因此，需对凝胶进行处理使其在目标挤压力度下以适当速率通过针头。 在图 7 中，凝胶粒度分布以累积体积百分比显示。 样品 A、B 和 C 的中位粒度 (Dv50) 为 480µm、425µm 和 203µm。 需将 G’ 值和屈服应力较高的强凝胶调整为粒度较小的粒子，使其容易通过针头进行注射。 样品 C 的粒度最小，因为在几种样品中，它具有最高的 G’ 值。 另一方面，样品 A 的粒度最大，因为在几种样品中，它是最弱的凝胶（可轻松通过针头）。所得粒度结果也与交联程度和分子量相关，因为高度交联的聚合物具有更高的 G’ 值，更为密集和紧凑。

图 7. 皮肤填充剂中凝胶粒子的粒度分布（累积体积）                 结论

对三种市售 HA 皮肤填充剂的流变学性质和粒度进行了表征和比较。 通过震荡测试测定了弹性模量 G’，这些值与凝胶硬度和强度（如弱凝胶或强凝胶）相关。 执行了稳态剪切测量，以检查不同剪切率下的粘度依赖性，同时执行了应力斜坡测试，以确定破坏凝胶结构所需的力度（即屈服应力）。 通过增加板间间隙对正交力数据进行测量，从而测定填充剂的粘着性（与震荡和屈服应力数据相关联）。 另外，测量了凝胶的粒度，因为其粒度会影响挤压情况，并且发现该情况也与流变数据相关联。

总而言之，HA 皮肤填充剂的流变学性质和粒度对于确定这些产品的性能（如易于送入、挤压力、注射、变形阻力、疼痛缓解）和应用（如细纹或深纹、面部轮廓整形）至关重要。