Mol Ther Nucleic Acids : 复旦大学附属中山医院研究团队揭示肺腺癌培美曲塞/顺铂耐药新机制

肺腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。顺铂（CDDP）+培美曲塞（PEM）联合化疗仍然是主要的治疗方案，然而药物抗性极大地限制了其治疗潜力。

2022年6月，复旦大学附属中山医院胸外科王群教授团队在《Molecular therapy nucleic acids》（最新影响因子10.138）上在线发表了题为“miR-6077 promotes cisplatin/pemetrexed resistance in lung adenocarcinoma via CDKN1A/cell cycle arrest and KEAP1/ferroptosis pathways”的文章，文中作者通过CRISPR-Cas9筛选，将miR-6077确定为肺腺癌中CDDP/PEM抗性的关键驱动因素，在细胞系和患者来源的异位移植模型中，通过功能实验证实，miR-6077过表达使肺腺癌细胞对CDDP/PEM耐受，机制与miR-6077解除联合化疗所致细胞周期阻滞及铁死亡有关。表明了miR-6077 在肺腺癌对CDDP/PEM敏感性中的关键作用，揭示了肺腺癌中miR-6077导致肺腺癌对培美曲塞/顺铂联合化疗耐药的关键机制，从而为临床实践中克服耐药性提供了一种新的治疗策略。

1. miR-6077的发现和功能验证

作者首先通过CRISPR-Cas9功能筛选试验，筛选出数个能够导致A549细胞对CDDP/PEM耐受的miRNA。经在A549细胞系中实验验证，发现其中过表达miR-6077 mimic导致细胞对CDDP/PEM显著耐受，表明miR-6077可能作为肺腺癌对CDDP /PEM化疗抗性的关键调节因子。

图1. 高通量筛选发现miR-6077调节铁死亡

2. CDKN1A和KEAP1是miR-6077的下游靶点

为了进一步深入了解miR-6077在调节 肺腺癌耐药性中的作用机制，作者结合在线数据库预测结果，并利用pull-down实验和RNA-seq 来寻找A549 细胞系中与miR-6077存在潜在结合作用的候选基因，并从中筛选得到CDKN1A和KEAP1以进行进一步的实验验证。miR-6077的过表达显着抑制肺腺癌中CDKN1A和KEAP1在mRNA和蛋白质水平上的表达，表明由CDDP/PEM处理引起的CDKN1A和KEAP1表达增强被miR-6077部分消除。双荧光素酶报告实验进一步证明CDKN1A和KEAP1是miR-6077的下游靶点。

图2. CDKN1A和KEAP1是miR-6077的下游靶点

3. miR-6077逆转CDDP/PEM诱导的细胞周期停滞和铁死亡

后续作者进一步研究了miR-6077究竟如何通过靶向抑制CDKN1A和KEAP1从而导致CDDP/PEM抗性。RNA-Seq发现CDDP/PEM处理后，细胞周期G2/M转变、脂肪酸氧化的调节和氧化应激通路均被富集。后续作者通过过表达miR-6077，发现其能够抵消CDDP/PEM处理后所致肿瘤细胞G2/M 阻滞及铁死亡，从而导致耐药。

图3. miR-6077保护肺腺癌细胞免于CDDP/PEM处理所致细胞周期阻滞及铁死亡

4. miR-6077导致CDDP/PEM耐受的下游机制

为了确定CDKN1A在miR-6077诱导的G2/M阻滞和CDDP/PEM抗性中的介导作用，作者在肺腺癌细胞系中过表达CDKN1A，发现CDKN1A过表达可逆转miR-6077诱导的CDDP/PEM耐药作用。以上表明miR-6077以CDKN1A依赖的方式调控细胞周期，从而使肺腺癌细胞对CDDP/PEM耐药。同时为了验证miR-6077靶向KEAP1的效应，作者在肺腺癌细胞系中回复表达KEAP1，结果发现KEAP1上调可以消除miR-6077 的影响，逆转miR-6077对CDDP/PEM引起的铁死亡的保护作用，从而导致耐药。

5. 体内实验证实miR-6077促进 肺腺癌细胞对CDDP/PEM的耐药性

研究者在小鼠皮下成瘤和PDX模型均证明在miR-6077注射后呈现一定的耐药性。

图4. 体内实验证实miR-6077促进肺腺癌细胞对CDDP/PEM的耐药性

1. 表明 miR-6077 驱动肿瘤细胞对CDDP/PEM耐药，是接受联合化疗的肺腺癌患者的预后标志物。

2. 阐明miR-6077通过特异性靶向CDKN1A 和KEAP1从而减轻CDDP/PEM所致肿瘤细胞G2/M期停滞和铁死亡的分子机制。

这些发现对我们理解肺腺癌的耐药性具有重要意义，针对上述分子可能为对CDDP/PEM治疗不敏感的肺腺癌提供新的治疗策略。

该研究前期Crispr/Cas9 screening部分中，Crispr/Cas9 全基因组文库（靶向20,060 个编码基因和1,854个 miRNAs (6 sgRNA/基因）慢病毒设计包装、转染A549 细胞（MOI 0.8）及后续药物筛选实验由吉凯基因提供，为本文提供了前期高通量基础。

复旦大学附属中山医院王群教授、詹成副研究员为本文通讯作者。复旦大学附属中山医院胸外科博士研究生毕国澍、梁嘉琪、赵梦男为并列本文第一作者。