Lonza 384孔Nucleofector高通量电转全基因组CRISPR，快速了解疾病机理、筛选药物靶点

2022-07-20 15:27:53, WEICHILAB 上海玮驰仪器有限公司

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当前生物医药行业面临着药物靶点同质化严重的问题，确认疾病的作用机制并寻找全新的、有效的、安全的药物靶点将成为转化医学和创新药物开发的有效措施，基于高通量全基因组CRISPR筛选可以为此提供很好的帮助。

CRISPR / Cas9已成为一种流行的基因编辑工具，因为它易于使用，并且与其他基因调节工具（例如siRNA技术）相比，脱靶效应更少。CRISPR/Cas9敲除筛选文库的形式主要有混合文库和阵列文库，已被广泛用于靶点识别和机制分析。虽然混合文库的 CRISPR/Cas9 筛选通常更便宜且耗时更少，但阵列式 CRISPR/Cas9 筛选在终点功能分析中提供了更多的技术灵活性。此外，与混合文库的 CRISPR 方法相比，阵列式 CRISPR/Cas9 筛选的基因型-表型相关性通常更加直接。

全基因组CRISPR筛选以识别人肝星状细胞中TGF-β诱导的肝纤维化驱动因素

题目:Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells

日期:2022-03-11

期刊:ACS Chem Biol

doi.org/10.1021/acschembio.2c00006

2022年3月11日,Takeda公司的开发团队在ACS Chem Biol上发表题为Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章，为了进一步了解肝纤维化的驱动机制，作者开发了一个高通量全基因组CRISPR/Cas9筛选平台来鉴定肝星状细胞(HSC)来源的TGF-β诱导的肝纤维化。该研究描述的功能基因组学表型筛选平台揭示了TGF-β诱导的肝纤维化的新生物学机制和肝纤维化的潜在药物靶点。

作者使用ACTA2蛋白表达作为HSC激活的水平，首先确认了HSC对TGF-β的反应，并确认了进行CRISPR/Cas9的最佳转染条件，包括电脉冲参数，crRNA及tracrRNA浓度，转染的细胞数，铺板密度等。

随后按照以下工作流程使用阵列式全基因组CRISPR/Cas9进行高通量筛选敲除潜在靶基因，通过计算ACTA2表达的抑制百分比及细胞活率，最终从19,027个基因中筛选出了52个基因，其中部分基因为已经被预测可以通过传统的小分子和抗体药物来调节干预。

为了确认这些基因在改善HSC纤维化方面的作用，作者在HSC中单独敲除了这些基因，并评估这些基因的缺失对TGF-β诱导的14种生物标志物转录谱的影响。

同时，构建器官型肝模型进行共培养，评估纤维化模型中上述基因的表达水平。与GEO profiles数据库中发布的公开可用的转录组数据进行对比分析。结果进一步支持了作者筛选的基因在肝纤维化发病过程中对HSC的潜在调控作用。

在对生物标志物转录谱影响的实验中，作者发现PSMC2的缺失可以抑制多个标志物，并进一步确认小分子抑制蛋白酶体活性可以解决TGF-β诱导的HSC活化。

随后，作者评估了小鼠肝纤维化bacTRAP试验中候选基因的表达水平，确认了这些候选基因在HSC中特异性富集。

作者还在UK Biobank上进行了MAGMA分析，确认部分基因的遗传变异可能会影响NASH和肝纤维化的生物标志物。

最后作者总结了这些研究的结果并对每个靶基因进行了评分。更高的分数表明该基因可能是肝纤维化的潜在靶标。

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总之，作者通过构建肝纤维化的生理模型，通过高通量全基因组CRISPR/Cas9筛选平台从19,027个基因中筛选出52个潜在基因可能在激活的HSC诱导的肝纤维化中起作用，通过一系列的验证及对比并为10个基因进行评分，这些基因将为开发下一代肝纤维化疗法提供了进一步可能。

本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做为递送CRISPR/Cas9的工具，在短时间内完成全基因组CRISPR/Cas9筛选。

在近几年的科学研究中，我们也看到了384-well Nucleofector可以很好的帮助客户完成高通量CRISPR/Cas9筛选，siRNA筛选以及细菌的CRISPR-Prime编辑的工作中[1-6]。

更多疾病机理研究和药物开发应用案例，可参考文章

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参考文献：

1. Susan Monkley, Catherine Overed-Sayer, Helen Parfrey. Sensitization of the UPR by loss of PPP1R15A promotes fibrosis and senescence in IPF.Sci Rep.2021 Nov 3;11(1):21584. doi: 10.1038/s41598-021-00769-7.

2. David E Gordon, Joseph Hiatt, Mehdi Bouhaddou. Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms.Science.2020 Dec 4;370(6521):eabe9403.doi:10.1126/science.abe9403. Epub 2020 Oct 15.

3. Irene P. Chen, James E. Longbotham, Sarah McMahon. Viral E Protein Neutralizes BET Protein-Mediated Post-Entry Antagonism of SARS-CoV-2.bioRxiv 2021.11.14.468537; doi:https://doi.org/10.1101/2021.11.14.468537

4. Alice Mac Kain, Ghizlane Maarifi, Sophie-Marie Aicher. Identification of DAXX as a restriction factor of SARS-CoV-2 through a CRISPR/Cas9screen.NatureCommunications. volume 13, Article number: 2442 (2022)

5. Elisabeth Anne Adanma Obara # 1, Diana Aguilar-Morante # 1, Rikke Darling Rasmussen.SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells.Nat Commun. 2020 Sep 18;11(1):4709. doi: 10.1038/s41467-020-18549-8.

6. Yaojun Tong,Tue S Jørgensen, Christopher M Whitford. A versatile genetic engineering toolkit for E. coli based on CRISPR-prime editing.Nat Commun. 2021 Sep 1;12(1):5206. doi: 10.1038/s41467-021-25541-3.

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8. Shan Yu*, Matthew Ericson, Andrea Fanjul, Derek M. Erion, Maria Paraskevopoulou, Erin N. Smith, Banumathi Cole, Ryan Feaver, Corine Holub, Narender Gavva, Shane R. Horman, and Jie Huang. Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells.

ACS Chem. Biol.2022 March 11; 17, 4, 918–929; doi: https://doi.org/10.1021/acschembio.2c00006

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