开拓单细胞功能表型认知新天地 —— IsoPlexis全自动单细胞功能蛋白质组学

近年来生物药如火如荼的发展，单细胞功能蛋白组学以其独特的技术理念为以下难题带来了解决方案：

• 如何评价PD1等免疫抑制剂的临床疗效？

• 如何预测肿瘤治疗方案的预后（标志物）？

• 如何提升CAR-T的制备工艺？

• 肿瘤病人发生耐药的核心机制？

• 如何评价自免病人的疾病状态？

生物学家对单细胞的追求一直没有止境：显微成像技术实现了对单细胞结构的观察；流式细胞术通过细胞表面表型分析实现了单细胞的分类鉴别；单细胞测序技术从转录组维度开拓了对单细胞功能的研究。然而，如果仅分析细胞转录组或表面表型，可能会漏掉单细胞诸多功能性表型信息，而这些功能性差异是涉及与临床疗效有关的关键因素。

IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学弥补了这一技术的空白，通过揭示单个细胞的功能表达，整合不同功能分析方法，用新的思维解读单细胞与疾病之间的关联。

IsoPlexis全球首次利用微流控微室反应和抗体条码技术，在单细胞水平对分泌的细胞因子谱和胞内磷酸化蛋白组等在活细胞状态下进行的高灵敏多重检测分析，对功能蛋白进行定性、定量。

一、探寻与CAR-T细胞治疗临床结果正相关的生物标志物

Gilead公司旗下Kite公司2018年发表在《Blood》杂志上的临床数据表明¹，抗CD19CAR-T细胞产品的多功能性指数(PolyfunctionalStrengthIndex，PSI)与非霍奇金淋巴瘤患者的临床缓解之间存在显著相关性，与其他检测参数（如流式检测免疫表型）相比是唯一具有显著性差异的指标。

相比于细胞培养上清中IFN-γ水平检测、CD4+与CD8+T细胞的比率以及各种T细胞表型频率等检测指标，单细胞功能性表型指标更具有临床预测意义，是统计学上可明确区分治疗有反应患者与无反应患者的指标。

Tem：effector memory, Tcm: central memory, Teff: effector

该结果突出了细胞产品的多功能性指数在治疗前预测癌症患者是否会对CAR-T细胞治疗产生临床缓解的潜力，以及改善输注前产品效能测试和指导细胞产品优化的潜力。

二、NK细胞基因编辑后的细胞治疗效能评价

Zhu2等发现借助IsoPlexis单细胞功能性分泌组学系统能够揭示基因编辑后自然杀伤细胞的杀伤能力异质性。单细胞多功能强度指数显示了基因敲除iPSC与WT野生型自然杀伤细胞的显著差异,与野生型相比敲除细胞显示出多功能细胞亚群的细胞数增加。在体外细胞实验以及体内小鼠实验中，基因敲除iPSC自然杀伤细胞均表现出更好的抗肿瘤活性

三、在工艺开发过程中，实现对CAR-T细胞精确分析，指导工艺优化的方向。

SrivastavaSK等3设计两种CAR-T制造方法（M1和M2），利用IsoPlexis的IsoLight系统优化CAR-T生产流程。单细胞多功能数据清楚地表明，与以前使用的M1制程相比，M2显著改善了双特异性CD19/CD22CAR-T细胞产品的整体多功能反应。通过M2制程生产的CAR-T细胞产品中，多种分泌型蛋白质的分泌水平更高。增强的多功能指标主要是由效应因子和刺激性细胞因子分泌驱动的。

四、预测PD-1免疫组合疗法疗效的新型生物标志物

2021年7月，德克萨斯大学安德森癌症中心的AdiDiab博士课题组表明4，在治疗转移性黑色素瘤的1/2期临床试验中，bempegaldesleukin(BEMPEG/NKTR-214)与Opdivo构成的组合免疫疗法达到53%的客观缓解率，34%的完全缓解率和74%的疾病控制率。他们利用单细胞蛋白质组学技术还发现一个新的疗效预测性生物标志物，使研究人员能够比以前的传统技术更早地评估患者对Nivo/BEMPEG治疗的反应，是有效预测患者总体缓解率的关键指标。

五、IsoPlexis 的功能蛋白质组学揭示脑脊液和血浆中的分泌特征

耶鲁大学医学院在2020年发表的一项研究表明，神经系统疾病是COVID-19的最初表现。该研究中使用了IsoPlexis的CodePlexSecretome检测了COVID-19中出现神经系统疾病患者的血浆和脑脊液中的细胞因子，发现脑脊液中有一种独特的炎症表型，但没有直接证据显示病毒入侵了神经系统。推测中枢神经系统的炎症是导致COVID-19病患癫痫发作而不是病毒直接侵袭神经系统。

IsoPlexis公司研发的IsoLight全自动单细胞功能蛋白质组学分析系统，能够帮助研究者进行兼顾单细胞和群组细胞水平全面的蛋白功能表征。

IsoLight是一套高度集成的端到端的系统，其功能相当于多台高端分析设备、液体处理器、清洗站、显微镜、培养箱和微阵列扫描仪，一次完成8个芯片的检测。系统的高度集成化赋予了仪器高度自动化的特点，整个检测和分析过程不需要手动操作，可无人值守地自动完成。

与IsoLight联用的IsoCode芯片应用微流控体系，含有12000个微室，可同时分离500-1500个单细胞，结合抗体条形码阵列技术进行单细胞蛋白组的检测。IsoLight集成培养箱，可将分离的活的单个细胞进行24小时之内的培养，在每个单细胞培养过程中，通过高度多重夹心免疫检测的方式，定量单个活细胞的分泌蛋白，种类高达32种。该实验获得大量的单细胞蛋白质组学数据集可通过多维生信分析软件IsoSpeak自动分析，在实验结束后的同一天即可完成分析，无数据分析压力。

IsoPlexis系统在全球拥有超过450个用户，其中包括全球前15大的制药企业及超过40%美国顶尖癌症研究中心，发表文章超过100篇，是一套被广泛验证、广泛使用的成熟系统。

IsoLight表征功能蛋白质，广泛用于免疫学、肿瘤治疗、细胞治疗和再生医学、传染病和疫苗、炎症疾病研究、神经生物学、癌症研究等领域。其提供的蛋白质组学功能层面的数据，与临床结果具有显著相关性，对临床研究和科学知识的发展带来革命性的变化。

1，RossiJ, et al. Preinfusion Polyfunctional Anti-CD19 Chimeric AntigenReceptor T Cells Associate with Clinical Outcomes in NHL. Blood, 2018

2，Zhuet al. Notch Activation Rescues Exhaustion in CISH-Deleted HumaniPSC-Derived Natural Killer Cells to Promote In Vivo Persistence andEnhance Anti-Tumor Activity. ASH Annual Meeting 2018

3，SrivastavaSK, et al. Abbreviated T-cell activation on the automatic CliniMACSProdigy device enhances bispecific CD19/22 Chimeric Antigen ReceptorT-Cell viability and fold expansion, reducing total culture duration.ASH Annual Meeting, 2018

4,Diab A, Tykodi SS, Daniels GA, Maio M, Curti BD, Lewis KD, Jang S,Kalinka E, Puzanov I, Spira AI, Cho DC, Guan S, Puente E, Nguyen T,Hoch U, Currie SL, Lin W, Tagliaferri MA, Zalevsky J, Sznol M,Hurwitz ME. Bempegaldesleukin Plus Nivolumab in First-Line MetastaticMelanoma. J Clin Oncol. 2021 Jul 13:JCO2100675. doi:10.1200/JCO.21.00675. Epub ahead of print. PMID: 34255535.

5，Farhadianet al. Acute encephalopathy with elevated CSF inflammatory markers asthe initial presentation of COVID-19. BMC Neurology 2020.

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