微型化、自动化和并行化的高通量层析工艺开发

2022-07-20 16:15:00, Repligen瑞普利金 帝肯(上海)实验器材有限公司



层析分离作为下游工艺开发的“主力”,在去除产品相关、宿主细胞相关和工艺相关杂质方面发挥着关键作用。复杂且表征不佳的原材料和进料、低进料浓度、产品不稳定性以及对工艺机制理解不足是层析步骤开发过程中面临的一些关键挑战。传统的工艺开发是基于试错评估来执行的,通常会导致工艺不理想。高通量工艺开发(HTPD) 平台涉及微型化、自动化和并行化的集成,并为更低时间和资源消耗的层析工艺开发提供系统方法。创建此类平台需要将工艺的机制知识与用于数据分析的各种统计工具相结合。鉴于生物制药行业今天面临的时间和资源方面的限制,建立这样一个平台至关重要。


用于生产生物药蛋白质的下游工艺开发通常涉及整合至少两到三个层析步骤,每个层析步骤对于分离下游工艺进料中存在的众多产品相关、宿主细胞相关和工艺相关杂质具有不同的选择性。在早期工艺开发过程中,分离主要是在试错法的基础上进行的,这主要是由于市面上大量可用的填料基质与所研究的产品之间存在复杂的相互作用。然而,这会导致工艺在效率、稳健性和功效方面不理想。高通量层析平台提供了一种潜在的解决方案,以获得对工艺和产品的理解。现有的各种关于生物药蛋白质层析步骤HTPD 的研究主要集中在确定获得更高产品回收率和纯度的操作条件。这在当今的质量源于设计(QbD)和过程分析技术(PAT)的开发模式中尤其重要,因其比以往任何时候都更需要全面了解工艺。


层析工艺优化的步骤


层析工艺的优化需分多个步骤进行。


1. 确定合适的填料基质:当前市面上有相当多的填料可供选择,其中很多新填料是在过去十年中推出的。填料基质的类型、粒径、孔径、配基类型、配基密度、压力-流速特性、规模放大适用性以及可重复使用性是选择最佳填料时需要考虑的一些填料关键属性。


2. 结合条件的优化:针对产品和填料基质的特定组合而优化结合条件是层析工艺开发的关键活动,涉及确定合适的缓冲液条件(pH、缓冲液摩尔浓度、缓冲盐等),以获得最佳的结合。基于实验设计 (DOE) 的方法通常用于探索这些参数的不同组合。


3. 洗脱条件的优化:通过增加盐浓度或改变pH 值,从填料基质中洗脱产物。随着最近混合模式等新型层析填料的出现,涉及pH 和盐梯度组合的更复杂的洗脱策略也在实践中。


4.工艺稳健性确认:开发的层析步骤对于预期的纯化是稳健的,这一点很重要。生物技术治疗产品的质量标准非常严格,因此,针对常规生产过程中各种工艺参数发生的典型变化,所开发的步骤应该相当稳健。


建立HTPD平台的步骤


步骤 I:实验前计划:此步骤涉及确定潜在的合适填料基质、选择需要研究的工艺参数以及需要评估的适当水平。一旦知道这些输入,就可以选择适当的DOE,并进行实验。


步骤 II:实验:此步骤涉及创建样品制备方案,其在 DOE 方案要求的各种条件(pH、缓冲液摩尔浓度等)下生成产品。通常使用产品浓缩和缓冲液置换来实现这一点。实验根据方案进行,包括平衡、蛋白质上样和洗脱循环。如上所述,具有必要灵敏度以及分析高通量样品形式能力的分析设备对于准确评估回收率和产品质量至关重要。


步骤III: 数据分析:HTPD 平台中实验的自动化和并行化使数据分析成为一项复杂的任务。定义最佳操作条件需要进行统计数据分析。应注意适当地识别在如此微量的条件下进行工作可能产生的各种错误。


步骤 IV:统计模型的验证:虽然 HTPD 能够在相对较短的时间内生成大量数据,但通过将结果与在更传统的实验室规模获得的结果进行比较来验证数据的有效性非常重要。目前存在多种统计方法,可以使用一种适当的方法来建立这种可比性。


统计数据分析对于得出准确的结论是必要的。可以使用最小二乘拟合来执行回归分析,以识别各种响应和独立过程变量之间的关系。可以执行95% 置信区间的方差分析 (ANOVA) 以检查数据的统计有效性。杠杆图可用于识别每个过程变量的影响以及它们之间对相关性能参数的交互作用。最后,使用计数器分析器的优化函数可以通过根据过程需要对响应变量设置约束来估计“设计空间”。


此外,还需使用传统柱层析法验证 HTPD 平台。一旦建立了 HTPD 平台,对HTPD 实验和传统的层析柱规模实验进行详细比较,对于平台的验证至关重要。HTPD平台能够在很短的时间内生成大量数据。虽然并非所有数据都需要在传统规模上进行检查,但重要的是在将分析结论应用于产品商业化之前,验证平台。一旦该平台得到验证,就可以将其用于使用类似层析分离的其它分子。



OPUS® RoboColumn® 微型预装层析柱


OPUS® RoboColumn® 预装层析柱自 2007 年起已被行业所采用,其设计与液体处理工作站配合使用,以实现全自动化的平行层析。



最多96根RoboColumn®预装层析柱(平行排列8种层析柱类型)可根据应用要求,独立排列在96孔阵列板上。层析柱内所含的填料在两个过滤器筛板之间形成柱床,根据填料压缩要求进行验证,以确保高效、良好不对称性以及稳健的层析性能。


  • 可预装用户指定的层析填料 - 已超300种填料类型

  • 以正确的轴向压缩一致的装填

  • 以液体处理工作站的移液速度控制的线性流速操作

  • 由于恒定的保留时间,具有经证实的规模放大和规模缩小性能 

  • 单位时间更多的样品数量,多重平行开发的能力


设计用于机器人液体处理工作站


OPUS® RoboColumn® 兼容Tecan和PerkinElmer的平台,推荐使用 Tecan Freedom EVO® 机器人工作站。


  • 同时自动步骤-梯度洗脱至96孔板中

  • 在集成的读板器中进行后续的分析

  • 灵活的软件向导 


OPUS® RoboColumn® 和 Tecan Freedom EVO® 机器人工作站的结合可获得完整整合的平台,实现最先进的小规模蛋白质纯化。



筛选和样品制备应用


工艺开发
  • 填料筛选 / 条件筛选


用于特定分子的纯化工艺的开发需要针对每一个层析步骤进行填料以及操作条件的评估。当在pH 3.7-7.0 的 8 种不同条件下比较12 种CIEX 填料时,在Tecan Freedom EVO® 上使用OPUS® RoboColumn® 可在 1.5 天内获得多达 96 个色谱图 (1536 个数据点)。


  • 在16分钟内平行进行8个层析分离,每个获得16个馏分

  • 在10分钟内制备96个独立缓冲液



样品制备 / 过程分析技术 (PAT)
  • 发酵过程中监测

  • 蛋白质表征

  • 药物发现


生物治疗药物的开发和生产需要对工艺中的中间体进行大量的分析表征工作。未纯化的样品在进行分析之前需要进行样品制备。OPUS® RoboColumn®  可一步实现多个样品的平行纯化。


在Tecan Freedom EVO® 上使用 OPUS® RoboColumn® ,每次 RoboColumn® 运行可获得 2mg - 24mg API (活性药物底物)。




参考文献:

P.M.Schmidt, Technical Optimization for High-ThroughoutPurification of Antibodies on Automated Liquid Handler. Methods in MolecularBiology, 2021, 2178.

M.N.S.Pedro, T.C.Silva, R.Patil, et al., Whitepaper on high‐throughput process development for integrated continuousbiomanufacturing. Biotechnology & Bioengineering, 2021, DOI:10.1002/bit.27757.


关于帝肯


作为一家在全球范围内提供生物制药、法医学和临床诊断实验室仪器和解决方案的供应商,Tecan(www.tecan.com)专门从事生命科学领域实验室自动化工作流程解决方案的开发、生产和分销。我们的客户包括制药和生物技术公司、大学研究部门、法医和诊断实验室。帝肯也是原始设备制造商(OEM),是开发和制造OEM仪器和部件的一员,然后由合作公司分销。


公司于1980年在瑞士成立,全球约3300多名员工,在欧洲、美国和亚洲均设有研发基地和生产中心,全球化的销售和服务网络遍布52个国家和地区。2020年,帝肯销售额为7.309亿瑞士法郎(约7.81亿美元)。帝肯集团的注册股份在瑞士六大交易所(TECN;ISIN CH0012100191)交易。


在帝肯,我们致力于推动全球医疗健康规模化创新。为此,我们与医疗保健和生命科学领域的客户紧密合作,除了提供尖端技术与高质量产品,旨在帮助用户深入了解对抗疾病,完善疾病发现机制,革新治疗方法,推动医疗创新成果从生命科学研究到临床的拓展,为全球的患者提供高效可行的临床诊断和治疗方案。


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