微型化自动化,抗体纯化工艺开发与验证的加速器

2022-07-20 16:15:00 帝肯(上海)实验器材有限公司


单克隆抗体(mABs)作为生物疗法正变得越来越重要,因此增加了对高通量工艺开发(HTPD)的需求。为确保可靠的结果,需要根据整个工作流程精心设计,并对影响药物生产过程的诸多变量彻底了解。因此,实验设计(DoE)方法对于确定统计的相关因素和相互作用至关重要。


传统上,蛋白纯化和分析的常用方法是液相色谱法,但为了节省宝贵的样品、试剂和时间,需要采用微型化和平行化的方法。这些测试系统还必须具有高度的稳定性,从而可靠地预测工业生产过程的最佳条件。OPUS® RoboColumns®微型层析柱(Repligen)提供了批量处理的替代方案,是小型化的理想选择。微型层析柱可提供与实验室级层析柱相同的单向流动,而且实验结果具有高度可比性。

本篇应用文献将为大家介绍 MSD 如何使用RoboColumn 层析柱来确定用于单抗纯化的HTPD方法,包含对用于结合-洗脱的阳离子交换(CEX)层析和用于flow-through阴离子交换(AEX)层析的研究。[1]


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材料和方法

自动化平台

所有微型层析柱实验都是在Freedom EVO® 200工作站上全自动化完成的,该工作站配备了 8 通道液体处理臂, 用于全自动处理样品板和板盖的移板机械臂,装载OPUS® RoboColumn层析柱的Te Chrom™模块,用于储存和收集微孔板中的洗脱液馏分的Te-Stack™,以及微孔板载架和一系列用于液体储存的储液槽和试管(图1)。


使用整合的Infinite® M200 PRO NanoQuant 酶标仪测定洗脱液和层析柱流出物的吸光度。


批次实验如前所述,[1] 使用配备Te VacSTM和Te-Shake™模块的Freedom EVO液体处理工作站对过滤板进行操作。


实验室级层析柱则在 ÄKTA™ avant 25和 ÄKTApurifier™ 10 (Cytiva)上。

图1:Freedom EVOware® 的工作台布局

用于微型层析柱实验

层析柱填料与规格

使用POROS™ 50 HS 填料(Applied Biosystems)用于结合-洗脱的CEX研究,Q Sepharose® FF填料(Cytiva)用于flow-through AEX实验。层析柱规格如下:

1)RoboColumns层析柱:

  • 填料柱床体积0.6ml,柱床高度3cm

2)实验室级层析柱:

  • 填料柱床体积6.9±0.3ml,柱床高度20±1cm

3) 生产级层析柱:

  • 填料柱床体积56±3L,柱床高度22±1cm

实验材料

IgG抗体是本次实验的测试材料。所有材料均在pH5.5、电导率为4-6 mS/cm的三醋酸缓冲液中制备。在微型CEX实验中,IgG浓度为2.0 mg/ml,聚集率为4.1%,宿主细胞蛋白(HCP)为1000 ppm;在AEX实验中,IgG浓度为6.4 mg/ml,聚集率为4.1%,HCP为3100 ppm。在生产级实验中,IgG的上样量为35 mg/ml 。表1列出了所有纯化步骤的实验参数。


CEX结合-洗脱实验的停留时间为4分钟,flow-through AEX 实验的停留时间为10分钟。所有实验中的条件都是取表征范围的中间点和极限点测量。由于使用RoboColumn层析柱,一次可进行八种条件的平行测试。

表1:筛选条件:1.*pH值取决于实验参数 2.**pH值和NaCl浓度取决于实验参数  3. ***浓度取决于实验参数

分析方法

使用Infinite 200 PRO NanoQuant 酶标仪分别检测上样、淋洗和洗脱流出液的浓度,每个收集馏分为200ul,通过路径长度校正补偿由于逐滴收集导致与预期体积的轻微偏差。使用NanoDrop™ 2000分光光度计(赛默飞)测量上样单抗浓度和经过RoboColumn 层析柱和实验室级层析柱收集的洗脱液中的单抗浓度。


使用高压分子排阻层析法(HPSEC)和 YMC预装 Diol-200层析柱(YMC公司)测定聚集物。


使用Freedom EVO 200平台进行自动化ELISA方法检测HCP。


2

结果

在各种pH/电导率条件下,无论是中间点还是性能极限点,OPUS RoboColumn层析柱分离得到的单克隆抗体、聚集物和宿主细胞蛋白质浓度与实验室级层析柱的结果表现出良好的关联性。在结合-洗脱CEX和flow-through AEX实验中,OPUS RoboColumn的性能与实验室级层析柱的预期一致。即使OPUS RoboColumn 层析柱的柱床体积仅为0.6 ml,其性能与柱床体积56 l的生产级层析柱相当,两种层析柱也表现出相似性能。OPUS RoboColumns的得率略低于生产级层析柱。


OPUS RoboColumn 层析柱的并行处理性能,显著提高了CEX过程研究的通量,使DoE试验的88个测试条件在一个月内便可完成。除了节省时间外,它还可以排除对该过程不重要的因素,因此,后续研究只需要对32个实验条件进行研究。


为了评估过程操作范围,在flow-through AEX实验对五个主要参数——上样量、待纯化样本pH值和电导率,以及淋洗pH值和电导率进行研究。通过微型层析柱测试了56种条件,实验室级层析柱测试了44种条件,表明DoE模型对实验变量的变化具有相似的灵敏性。


flow-through AEX实验的验证结果表明,微型层析柱具有与实验室级层析柱相同的性能预测能力,而且相当稳定。由于微型层析柱的小型化和并行性,实验时间和所需材料几乎减少一个数量级。

*更详细实验数据请阅览参考文献


3

 讨论和结论

RoboColumn 层析柱被用于评估和完成高通量的DoE 实验,以实现工艺确定。两种策略都证明了微型层析柱表现出与传统实验室级层析柱相同的性能。呈现的数据足以证明微型层析柱是一种有效的微型工艺验证模型,可作为补充,甚至有些情况下可代替目前所用的层析方法,用于生物制品工艺过程的评估。


感谢引用文章的共同作者John Welsh为我们提供的数据和有趣的科学讨论。


 参考文献

Petroff, MG. et al. High throughput chromatography strategies for potential use in the formal process characterization of a monoclonal antibody. Biotechnol.

Bioeng, 2016, 113, 1273-1283.


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● 自动化高通量平行层析法,加速早期纯化工艺开发

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