内毒素面前，鲎试剂的前世今生

像弗莱明发现青霉素一样，鲎和内毒素第一次碰撞源于科学家Frederik Bang的一只被弧菌感染的美洲鲎。Frederik Bang当时正孜孜不倦地研究着鲎的血液循环，这只不幸感染的美洲鲎死时血液几近半凝固状态，这一奇特现象点燃了Bang的求知内心。

几经验证，Bang和助手Jack Levin最终发现鲎的血液细胞或者变形细胞内含有一种凝固剂，当存在革兰氏阴性细菌时就能形成凝胶。两人随即意识到这种凝胶反应可以作为检验热源物质的"fire alarm"——报警系统。

科学家Frederik Bang

1977年，美国食品和药物管理局（FDA）开始允许制药公司用鲎试剂（LAL）替换低效而繁琐的兔子毒素测试试验。

兔子热源检测，费时而昂贵；鲎试剂凝胶法，更经济快速 （图片来源于百度百科）

同时，基于鲎试剂人们开发出各种不同的方法，每种方法都有其独特的特点。例如，凝胶法鲎试验(PYROGENT™) 提供了一种简单的阳性/阴性结果，大多数药典专论将其作为官方仲裁试验。

如下图所示，样品经多次稀释后加入鲎试剂，在水浴锅中孵育1h，翻转180°后，看凝胶是否滑落来判断是否有内毒素。该方法不需要复杂的设备，水浴锅即可，但水浴锅本身是潜在的污染源，而且需要定期换水，使用上并不方便。另外，样品量比较多时会带来较大的人力负担。

鲎试剂凝胶法检测原理图示

图片来源：https://kepleybiosystems.com/hcrbi

再者，就是定量法。定量法可以借助于光吸收酶标仪设备，读取样品与鲎试剂作用后吸光值的变化，通过标准曲线，计算出样品内毒素的含量，以量来评估是否可以放行。相比凝胶法会更准确；其次，样品量比较大时，在多孔板上设置好对照组和样品组，让设备自行运行最后分析出结果即可。从长期来看，比较节省人力成本，减少人力负担。

定量法又可细分为动态浊度法(PYROGENT™-5000)和动态显色法(Kinetic-QCL™)。

动态浊度法分析检测

PYROGENTTM-5000 Kinetic Turbidimetric LAL Assay

这些方法具有更小的样品干扰，当面临不同的生物制品，比如疫苗制品，新冠疫苗，狂犬疫苗，基因和细胞治疗制剂，mAb等时，检测准确性和灵敏性更高，检测限可以低至0.005EU/mL。目前，中国药典（NMPA）、FDA、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、日本药典(JP)接受所有上述鲎试验方法。

不同区域的鲎存在显著差异性，比如东方鲎和美洲鲎个头差异就很大。批次间的稳定性也会因鲎的个体差异性而不同。

目前市场上有多种国产和进口鲎试剂品牌，国产鲎试剂在价格上有竞争优势，进口鲎试剂在国际市场上更受认可。选择什么样的鲎试剂和后期临床前申报是息息相关的。从市场反馈来看，若需在不同国家获取申报资格，多会选择在国际上更受认可的品牌，比如 Lonza 的内毒素检测试剂盒。

鲎的个体差异性

图片来源：https://kepleybiosystems.com/hcrbi

鲎的历史可以追溯至古生代的泥盆纪，那时，恐龙尚未出现，原始鱼类刚刚问世。然而，自从鲎被用来开发检测内毒素之后，世界各地均出现疯狂捕捞过度开采的现象。就我国而言，因索取无度，才20余年我国沿海的鲎已从遍布海滩到几乎绝迹。

鲎采血现场

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幸运的是，能够取代鲎试剂的检测方法已经问世。Lonza科学家开发了PyroGene™重组表达的C因子检测方法。C因子是内毒素激活的鲎凝固级联反应中的第一个组成部分，只用于内毒素检测，是进行内毒素释放测试的可靠替代方案。

LAL和重组C因子检测的原理示意图

重组C因子是一种化学合成的试剂，性状更稳定，均一性相对也更好。试剂价格目前和鲎试剂相当，后期如在国内外广泛应用起来，价格会比鲎试剂更具竞争优势。

重组C因子检测试剂盒

目前，FDA现已批准重组C因子作为鲎试剂的替代方案，用于生物制品的放行和过程检测。2020版中国药典通则9301附录里面也有关于重组C因子的检测说明，但是如需放行检测，还需要做相关验证试验。

内毒素检测只是生物制剂质量控制的冰山一角，然而这一角冰山却足以毁灭一个物种。正如更多更好的药物可以造福更多的人，对环境更友善的检测方法也能造福更多的“小鲎小虾”。