Environ Int | 浙江大学公共卫生学院周舟课题组在环境科学顶刊首次发文揭示镉暴露与糖尿病的关联

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镉是一种广泛存在于环境中的有毒重金属,广泛存在于环境中。慢性和低剂量 Cd 暴露与循环毒性、肾损伤、中枢和外周神经毒性、肺部疾病、角化过度和皮肤棘皮症有关。此外，镉化合物作为已鉴定的致癌物也参与了人类肺癌、前列腺癌和肾癌的发病机制。流行病学研究表明，尿镉含量与空腹血糖受损显著相关。然而，镉暴露胰腺β细胞代谢毒性特征与潜在的分子事件及机制尚不清楚。

2022年03月，浙江大学公共卫生学院周舟团队在环境科学顶刊《Environment International》杂志发表题为 “Cadmium perturbed metabolomic signature in pancreatic beta cells correlates with disturbed metabolite profile in human urine”( IF13.352)的研究成果，通过采用转录组，非靶代谢组学等技术，首次揭示了镉诱导的代谢紊乱在胰岛β细胞功能障碍中的重要作用，强调了从人群水平控制镉暴露降低糖尿病发病风险的重要性。

胰腺β细胞功能障碍是糖尿病发病机制中的关键事件。葡萄糖及其代谢物、脂质分子及其代谢物协同调节胰腺 β 细胞功能。脂毒性代谢物通过诱导细胞氧化应激、内质网对胰腺 β 细胞中的胰岛素产生和分泌产生不利影响(ER) 压力和线粒体损伤。因此，阐明代谢紊乱和脂毒性代谢物在 Cd 诱导的胰腺 β 细胞功能障碍中的作用非常重要。Cd 暴露是否以及如何扰乱线粒体 TCA 循环并产生脂毒性代谢物对于了解 Cd 暴露的代谢毒性至关重要。

本研究的目的是揭示胰腺 β 细胞中 Cd 暴露的代谢组学特征，从而为了解 Cd 诱导的与胰腺 β 细胞损伤和糖尿病发病机制相关的代谢毒性提供全代谢组水平的新证据。

1、镉暴露在体内和体外造成胰腺β细胞功能障碍

为了测试镉暴露对胰腺β细胞功能的毒性作用，作者首先检测了镉暴露后小鼠的血糖水平（图1A）。此外，作者进行了腹腔内葡萄糖耐量试验以测量胰腺β细胞功能（图 1B-C）。通过HE染色观察Cd暴露小鼠胰岛的形态学损伤（如图1D所示）。通过免疫荧光染色用于特异性标记胰腺β细胞和α细胞。发现在镉暴露后分泌胰岛素的β细胞显著减少，而胰高血糖素分泌细胞没有改变（图1E）。

为了进一步验证 Cd 暴露是否在体外诱导胰腺 β 细胞功能障碍，作者在体外测量了 CdCl 2对 MIN6 细胞的毒性作用 (图 1F-G）。同时检查镉暴露对 MIN6 细胞胰岛素分泌的剂量和时间影响（图1 H 所示）。在 Cd 暴露后 24 小时，MIN6 细胞分泌的胰岛素含量显著降低。在一项时程研究中，观察到胰岛素分泌的减少早在Cd暴露后 3 小时就发生了(图 1 I)。综上所述，这些在体内和体外数据表明，镉暴露会导致葡萄糖耐受不良、胰岛受损、抑制胰腺 β 细胞胰岛素分泌。

细胞器之间代谢物的动态相互作用是协调细胞内代谢平衡的重要机制。为了揭示 Cd 暴露显著改变的代谢物的细胞内区室，作者进一步分析了 MIN6 细胞中受扰动的代谢物的亚细胞分布。发现扰动的代谢物广泛分布在细胞质和细胞器中（图 3A)。作者进一步分析了这些位于线粒体的代谢物的化学超类组成。发现核苷、核苷酸和类似物占线粒体代谢物的大部分（图 3 B）。在分层聚类分析的热图中观察到 28 种线粒体代谢物的两个不同的差异，如图 3所示C，表明线粒体代谢受到镉暴露的显著干扰。在这 28 种代谢物中，26 种代谢物显著增加，而2种代谢物（DL-2-氨基己二酸、甜菜碱）显著增加减少。

细胞内细胞器之间代谢通量的动态串扰调节细胞功能。细胞器中受干扰的代谢物会破坏代谢通量和细胞器相互作用。因此，作者通过维恩图分析进一步剖析了位于线粒体、溶酶体和ER中的改变代谢物的组成（图 3 D）.鉴于线粒体是细胞氧化应激的关键调节剂，而过氧化物酶体被认为是脂质和氧化还原信号网络中的关键枢纽，因此使用维恩图分析了线粒体和过氧化物酶体中受到干扰的代谢物。作者发现线粒体和过氧化物酶体中均存在 9 种改变的代谢物 (图 3 E)，这表明线粒体功能和氧化应激可能会受到 Cd 暴露的代谢毒性的干扰.

4、Cd 暴露扰乱了代谢途径和升高的脂毒性代谢物

为了揭示 MIN6 细胞中 Cd 暴露干扰的显著差异的代谢途径，作者通过KEGG分析表示差异显著性的p值和反映受影响途径影响严重程度的差异表达代谢物的数量（如图 4 所示），结果表明 Cd 暴露会导致 MIN6 细胞出现整体代谢紊乱。线粒体TCA循环、甘油磷脂代谢、胆碱代谢、嘧啶代谢、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢等代谢途径均受到明显干扰。

为了进一步描述脂毒性代谢物与线粒体代谢物之间的关系，作者进行了 Pearson 相关分析。相关网络表明脂毒性代谢物与线粒体代谢物密切相关（图4C）。这些结果支持线粒体作为镉暴露代谢毒性的主要靶细胞器。

5、Cd 暴露在线粒体 TCA 循环和相关脂肪酸氧化中的基因表达失调

为了验证 Cd 暴露对线粒体 TCA 循环和相关脂肪酸氧化的毒性作用，作者运用转录组测序检测了 Cd 暴露后 MIN6 细胞和小鼠胰腺中调节线粒体 TCA 循环和相关脂肪酸氧化的基因的 mRNA 表达。如图5A，在MIN6细胞（图5A）和小鼠胰腺（图5A）中， Idh3b、Ogdh和Etfdh mRNA表达显著下调，Mdh2、Etfa mRNA表达显著上调。Cd 暴露后。这些数据表明 Cd 暴露会失调线粒体 TCA 循环中的基因表达。

在验证 Cd 暴露对脂肪酸氧化的影响时，作者检测了脂肪酸氧化的关键调节因子Fa2h、Pycr1和Hsd17b10基因的 mRNA 表达。发现Fa2h和Pycr1在MIN6细胞和小鼠胰腺中mRNA表达显著下调（图5B-D）。总之，这些结果进一步表明，镉暴露通过失调基因表达损害线粒体 TCA 循环和相关的脂肪酸氧化。

为了探索在 MIN6 细胞中鉴定出的扰动代谢物是否与人类接触 Cd 的代谢毒性相关，作者首先在人样本进行了非靶向代谢组学分析以鉴定 Cd 扰动的尿代谢物，然后评估与糖尿病发病机制的相关性。对比分析了15名高浓度镉暴露工人和15名健康人的尿液样本（样本策略）。主成分分析（PCA）的得分图显示健康受试者和 Cd 暴露工人之间存在显著差异（图 6A)，表明 Cd 暴露导致尿液中代谢物谱发生显著变化。Cd 暴露导致尿液中的代谢物显著扰动（图 6 B）。

在 Cd 暴露工人的尿液中共鉴定出 53 种受干扰的代谢物。作者选择前20个受扰动的代谢物进行ROC曲线，用于评估作为Cd毒性生物标志物的特异性和敏感性。代谢途径富集显示 34 种代谢途径受到人类 Cd 暴露的显著干扰（图6D）。

为了测试受扰动的代谢物是否可以反映线粒体代谢的紊乱，作者发现线粒体代谢特征被显著破坏。线粒体中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环、胰高血糖素信号通路、ABC 转运蛋白和硫胺素代谢的层次聚类受到干扰（图 6 F）。这些结果表明，Cd 对线粒体代谢的毒性可以通过尿液中的代谢物紊乱来指示。

首先，作者检查了 Cd 扰乱胰腺 β 细胞中的代谢物是否共存于 Cd 暴露工人的尿液中。结果显示，14 种受干扰的代谢物共存于 Cd 暴露的 MIN6 细胞和 Cd 暴露工人的尿液中（图 7A）。在细胞和人体尿液样本中这 14 种重叠代谢物中，12 种在 Cd 暴露工人的尿液中显著增加，2 种显著减少。

尿液中受干扰的代谢物已被认为是预测和诊断糖尿病的代谢组学生物标志物。接下来，作者从暴露于 Cd 的工人中受扰动的代谢物中筛选出作为糖尿病代谢组学生物标志物的尿液代谢物。与对照组相比，Cd 暴露工人尿液中 11 种糖尿病代谢组学生物标志物的丰度显著改变（图 7 B）。Veen 图显示，人尿中 11 个代谢组学生物标志物有 3 个重叠代谢物，细胞和人尿样品中有 14 个共存代谢物（图 7C）。最后，作者检查了 3 种重叠代谢物作为 Cd 暴露代谢毒性生物标志物的特异性和敏感性。进行 ROC 曲线。L-谷氨酰胺 (0.751)、硫胺素 (0.960) 和牛磺酸 (0.849) 在 95% 置信区间内的 AUC 值表明这 3 种代谢物具有良好的预测性能（图 7 D-F）。

总之，这些结果表明，在全代谢组水平的 MIN6 细胞中鉴定出的扰动代谢物与人类接触镉的代谢毒性密切相关。尿液中的 L-谷氨酰胺、硫胺素和牛磺酸可用于预测和监测 Cd 诱导的人类代谢紊乱。

由于环境因素和遗传脆弱性，糖尿病的风险被认为是频率上升的。作为环境中最危险的因素之一，Cd 被发现在肝脏和胰腺中积聚，在那里它对碳水化合物代谢产生有害影响并破坏葡萄糖稳态。镉暴露还会通过改变和损害相关的关键酶活性来干扰糖酵解、糖生成和糖异生过程，失调激素平衡，如胰岛素、糖皮质激素和胰腺和肾上腺中的儿茶酚胺。此外，镉暴露增强了活性氧的产生并抑制了多个器官之间的抗氧化防御机制。尽管大量研究支持镉诱导的代谢紊乱与糖尿病发病率之间的关联，但这种代谢毒性的确切机制仍然未知。

在作者的研究中，将基于 LC-MS/MS 的非靶向代谢组学分析应用于 Cd 暴露的 MIN6 细胞，以深入了解代谢组水平的代谢变化。证明了与环境相关的 Cd 暴露改变了 MIN6 细胞中的代谢组学特征，这些数据表明，受扰动的代谢物可能直接损害这些细胞器的功能并且细胞器之间的代谢相互作用受到干扰。此外，Cd 暴露导致脂毒性代谢物强度显著增加。KEGG 通路分析显著揭示了 Cd 暴露破坏了以线粒体 TCA 循环和甘油磷脂代谢紊乱为特征的代谢平衡。据作者所知，这是第一项描述胰腺 β 细胞中镉毒性的代谢组学特征并将代谢组学特征与镉诱导的人体代谢毒性相关联的研究。

流行病学研究已经建立了镉暴露与糖尿病之间的直接联系。Cd 毒性对糖脂代谢的确切机制尚未阐明。由于胰腺 β 细胞是体内产生和分泌胰岛素的唯一来源，揭示胰腺 β 细胞中全代谢组水平的 Cd 诱导的代谢紊乱对于了解 Cd 暴露与糖尿病风险增加之间的关系具有重要意义。从这个意义上说，结合生物信息学分析的非靶向代谢组学的应用可能是揭示镉诱导的胰腺β细胞代谢毒性特征的有力策略。代谢组学的主要价值在于它测量代谢物并确定在短时间内整合基因表达和环境调节的途径，以揭示系统的新兴特性。

在作者目前的研究中，作者证明 Cd 暴露会诱导小鼠葡萄糖升高和不耐受，并抑制胰腺 β 细胞胰岛素的产生。在作者的体外研究中，当 MIN6 细胞用与环境相关的 Cd 暴露，胰岛素分泌明显受到抑制。代谢组学分析分别鉴定了 76 种显著扰动的代谢物。这些受干扰的代谢物影响胰腺 β 细胞功能的潜在机制需要进一步研究。

由于 Cd 暴露会导致 TCA 循环和受扰动的代谢物表明的甘油磷脂代谢的扰动，作者确定了与这些代谢过程相关的酶的基因表达的变化。在镉暴露后，在 MIN6 细胞和小鼠胰腺中，TCA 循环相关基因，脂质代谢相关基因紊乱。因此，作者目前的研究结果支持 Cd 诱导的酶失调导致 TCA 循环和甘油磷脂代谢紊乱的推测。

因此，作者提出的新发现对于全面了解环境相关 Cd 暴露的代谢毒性和确定早期医疗干预的分子靶点具有非常宝贵的价值。

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