长沙晨辰医药未知杂质结构修正案例

国内一家药物研发企业在研究由2-氯-D-苯丙氨酸合成二氢吲哚-2-羧酸的过程中，发现在反应产物中存在一较大含量的未知结构杂质，二氢吲哚-2-羧酸合成反应方程式如图1。经LC-MS测试后，分子量大致为目标产物的两倍。结合反应机理和起始物料结构，合成工艺人员推测该未知杂质可能为两分子起始物料之间结合，两分子间发生了取代反应，生成的未知杂质结构对称如图2所示。

图2  合成工艺人员所推测目标杂质结构

图4  目标杂质碳谱谱

为了弄清楚未知杂质的结构，此项目交由长沙晨辰药物科技有限公司进行进一步研究。由客户图3及图4可知，原先目标杂质纯度较差，为了得纯度不低于95%杂质对照品降低NMR结构鉴定难度，长沙晨辰医药科技有限公司采用制备液相对目标杂质进行进一步分离纯化。目标杂质经制备液相纯化后的HPLC测试图如图5所示，纯度为97.80%。同时采集纯化后样品的NMR碳谱，与纯化前相比杂峰明显减少，这对准确鉴定杂质结构非常有意义，排除了NMR谱图上杂信号的干扰。

采集分离纯化后杂质样品的高分辨质谱和NMR一维谱及二维谱（COSY、HSQC-DEPT和HMBC）谱图后。将谱图在ACD NMR Workbook软件中打开，查看其HSQC-DEPT谱图发现，其信号基本上还是成对出现，但是成对出现的信号两者间氢碳化学位移存在一定的差异，如CH两信号（H3.72，C53.24）（H4.82，C69.45），通常此位置CH为连杂原子N的信号，进一步证明目标杂质结构为非对称结构。

结合上述分析结果，重新考虑目标杂质的结构。一分子2-氯-D-苯丙氨酸生成了二氢吲哚-2-羧酸后与另外一分子2-氯-D-苯丙氨酸进一步发生了分子间取代反应，生成的产物结构以及反应途径如下：

图7  推测的目标杂质结构及其反应路径

图8  在ACD NMR Workbook中结构与HMBC信号归属后的结果

从归属的结果可以看到，结构上所有的连接线（HMBC和COSY）信号均没有问题，同时结构上用不同色块标示碳谱化学检查结果，ACD NMR Workbook在归属时会自动比对实验谱和标准谱图，如果碳谱的化学位移偏差小于3ppm则在结构上该原子用绿色色块标示，如果偏差在3-10ppm之间，该原子会使用黄色标记。该结构的归属质量检查大部分为绿色标记，这证明化学位移检查没有太多的问题。这里需要特别关注的两个连N的CH归属情况，2号位C化学位移为69.45ppm，19号位为53.24ppm，为何2号位化学位移比19号位低场？这是因为1号位N（结构上缺省）上孤对电子向两侧苯环p→π共轭，这大大降低了N上的电子云密度，进而降低了2号位碳上的电子云密度，使得2号位碳更偏向低场，而20号位N不存在此效应，所以相对于2号位碳19号位碳的化学位移要偏高场。