2022-07-15 02:10:14, 天美色谱 天美仪拓实验室设备(上海)有限公司
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“氨基酸(aminoacids)是组成蛋白质的基本单位”,在人的生命活动中不可或缺。
氨基酸分析仪,是用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的仪器。进行氨基酸分析前,必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸。它是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱仪。有的样品中氨基酸以游离态存在,而有的样品中氨基酸以蛋白或多肽形式存在,当然,大多数样品氨基酸以两种形式同时存在。根据关注点不同,我们常常把样品分为水解样品和游离样品。
# 水解样品(蛋白质及多肽) #
图 | 水解样品(蛋白质及多肽)
水解样品一般关注的是氨基酸以蛋白或多肽形式存在的样品,氨基酸主要是以肽键结合,需要设法将肽键打开,水解成单个游离氨基酸,而当前还没有哪一种水解剂能将所有的氨基酸毫无破坏的水解出来,这就决定了氨基酸总量测定前处理方法的复杂性和多样性。
1 15种常规氨基酸(常规酸水解)
酸水解法通常我们使用(常规)酸水解法测定天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸等15 种氨基酸。
2 含硫氨基酸氨基酸(氧化水解)
氧化水解含硫氨基酸需先用过甲酸将胱氨酸、半胱氨酸氧化为磺基丙氨酸,将蛋氨酸氧化为蛋氨酸砜,此两种物质在酸水解过程中稳定且与其它氨基酸易分离,然后再将蛋白进行酸水解,进行测定。在氧化水解处理过程中,除色氨酸不能测定外,某些芳香氨基酸也可以部分氧化、破坏,而不能测准,因为在HBr作为氧化中止剂时,酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸均会被部分氧化而不能测定,如果用偏重亚硫酸钠为中止剂时,酪氨酸不能测定。
3 色氨酸(碱水解)
碱水解相对于酸水解而言,碱水解时破坏的氨基酸要多很多,但酸水解会被破坏的色氨酸在碱水解时却能保持稳定,因此碱水解就是用以分离色氨酸。通常会使用氢氧化钡,这样水解之后就必须用CO32-或SO42-来沉淀钡离子。而且氨基酸可能会因为沉淀盐的吸附而损失。亮氨酸在碱水解和酸水解过程中都很稳定,它可以用来检查这种吸附产生的损失。
# 游离样品(游离氨基酸) #
图 | 游离样品(游离氨基酸)
游离氨基酸游离样品关注的是样品中的以游离态存在的氨基酸,需要考虑的是提取和除杂质。
1 提取
提取主要针对的是动物组织,植物组织,以及其他含游离氨基酸的固体样品,这类样品需要把氨基酸从固体中提取出来;如果样品中含有牛磺酸,而且用钠系统分析,则应采用A液作为稀释液,用样品稀释液或者水稀释会有轻微干扰,对牛磺酸含量较小的分析会有影响。
2 去除杂质
去除杂质主要是去除样品中可能含有的蛋白质,重金属以及其他干扰物质。金属离子用EDTA去除,蛋白沉淀剂应用较多的有苦味酸、磺基水杨酸(SAA)、三氯乙酸、乙醇等。当样品中含有较多3-6肽(分子量500-1000)时,可用约0.5%磷钼酸进行沉淀,但最终上机时的磷钼酸浓度应小于0.1%(1mg/mL),脂肪含量高的样品需脱脂(索氏提取)。
结论
本文介绍了经过Scion Artemis 6000实验验证过的含氨基酸样品前处理方法,符合GB/T18246&GB5009.124等相关标准
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