2022-06-28 23:23:18, 徐玲丽 丹纳赫生命科学
国际人用药品注册技术协调会(ICH)、美国食品药品监督管理局 (U.S. FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和其他国家的监管机构都有关于 HCP 监测的指南,普遍认为需要采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP,通常为1至100ng/ml。
典型的单抗不同纯化阶段HCP浓度变化情况
MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663
工艺中的HCP的监控和产品放行,双抗夹心酶联免疫法(ELISA)一直被用作HCP检测的金标准。这主要是因为ELISA可以在mg/ml级别的产品蛋白中有效地检测ng/ml级别的HCP残留,并且ELISA方法成熟,可操作性强,是经典的免疫学检测方法。
HCP ELISA的原理是先将HCP抗体包被酶标板,孵育待测样品,通过HCP抗体捕获和富集样品中的HCP,再加入与包被酶标板的抗体种属不同的,酶联报告基团的HCP抗体,结合已被富集的HCP,通过底物显色或荧光的方式,最终定量计算HCP。
丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器(MD)拥有各类不同功能的酶标仪,适用于检测不同信号的ELISA实验。特别是SpectraMax i3x多功能酶标仪具有光吸收、荧光、化学发光和FRET检测功能,兼容客户端模块化升级功能,可以根据需要任何时间随意升级至荧光偏振FP、HTRF、AlphaScreen、Western Blot、细胞成像和带有注射器模式下的快速动力学检测。
MD的SpectraMax i3x多功能酶标仪
由于需要检测HCP的工艺步骤多,ELISA的操作流程繁多,有大量的移液和清洗步骤,靠人工操作,难免会出现移液体积不准、漏加等人工操作误差导致的信号弱或者过饱和,以及标准曲线线性不佳、污染等问题。丹纳赫生命科学拥有贝克曼库尔特自动化工作站搭配MD酶标仪的整合方案,可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作,大大避免实验误差及重复的人工劳动。
贝克曼库尔特自动化工作站进行ELISA实验流程
自动化工作站进行ELISA实验的结果
但ELISA检测HCP不能从结果中得知样品中有哪些HCP,或者用于ELISA检测的抗体与哪些HCP发生了免疫反应,而且HCP的组成与丰度在生产的各个阶段与最终产品都各自不同,因此需要采用正交方法进行相互验证,互为补充。LC/MS方法可对生物治疗性蛋白质样品中的HCP进行鉴定和定量。
有文献采用SCIEX 的高分辨质谱仪结合高效液相色谱仪,开发了基于一维UHPLC-MS检测HCP的方法。在上游细胞上清液收获阶段,采用数据依赖性采集模式进行较高浓度的HCP检测,可以鉴定到上千个蛋白,建立数据库,同时可以得到HCP特异性肽段的离子对信息;在下游纯化阶段对较低浓度的HCP采用数据非依赖性SWATH的采集模式,可以获得低浓度HCP的定量信息,同时还可以根据HCP的特异性肽段的离子对信息,追踪特异性HCP在不同纯化阶段的浓度变化情况。
1D UHPLC-MS HCP检测流程
MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663
SCIEX TripleTOFTM
系列高分辨质谱系统
SCIEX X500 系列
高分辨质谱
该方法不但能对未知HCP进行鉴定,还能同时进行多种HCP的检测,通量可达20个样本/天,采用48种已知蛋白作为标准品进行灵敏度定量测试,检出限可达7.56-0.5ppm。
HCP LC-MS与ELISA结合使用,可降低HCP监督的风险并提供有关HCP特性的有价值信息,以指导下游工艺的开发。
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