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在本研究中，当氮源受限制时，铵态氮比硝酸盐更容易刺激铜绿假单胞菌的初始生长。即使当细胞再次缺乏氮时，再添加氮源后，氨组相对于硝酸盐组也观察到快速生长。当以铵态氮供应充足的培养时间延长时，从第5天开始的7天内，铜绿假单胞菌的生长变慢，而在同一时期观察到硝酸盐组促进了生长，是铵处理的1.36倍。同时测定培养液中氮含量的变化，结果显示与细胞的生长结果一致。

图1. 不同氮营养条件下铜绿假单胞菌生长和氮利用的变化。

铜绿假单胞菌对铵供应的快速生长反应，培养一天后，所有铵组的净光合速率迅速增加，显著高于硝酸盐组。然而，在培养基中的氮含量耗尽后，2 mg/L氮处理组P_n值开始下降。这进一步强调了光合作用和氮代谢之间的密切关系。在10 mg-N/L组中，充足的硝酸盐供应确保了P_n的持续增加，之后由于氮耗尽，P_n降低。然而，氨氮处理的P_n在两天后急剧下降，一直低于初始值直到培养结束。这表明细胞周围过量的铵离子含量导致绿脓杆菌光合作用的下调。综合分析，将氧释放的减少可能归因于两个方面：一是由于过量的光能积累导致PSII的下调，另一个是通过与铵离子和水分子之间的OEC结合位点的竞争减少光驱动的水氧化。

图2. 不同氮营养条件下铜绿假单胞菌光合放氧（P_n）和饱和辐照度（Isat）的变化。

测定每个样本的MC产量，并将其计算为细胞配额值。结果表明硝酸盐培养有利于MC的生物合成，氮饥饿诱导毒素产生。当提供足够的氮时，硝酸盐下的MC总量在培养期间没有显著变化，但过量的铵会导致细胞内MC释放到环境中。

图3：不同氮营养条件下铜绿微囊藻胞内MC和胞外MC的变化

当环境中氮的浓度和形态随着营养条件的改变，细胞内氮代谢途径也相应改变。转录组分析结果表明，在硝酸盐培养的铜绿假单胞菌和氨氮培养的铜绿假单胞菌之间，超过14%的总基因表达存在显著差异。其中，400个基因上调，365个基因在硝酸盐条件下相对于铵态氮水平下调（图4A）。DEGs的层次聚类显示，具有类似功能或参与相同生物过程的基因聚集在同一组中，并且在组内的样本中观察到DEGs表达的重复性较好。

对差异表达基因进行GO富集分析，结果表明，493个DEG主要注释为21个GO功能分类。在生物过程类别中，含有大量DEG的次要功能是金属过程、细胞过程、生长和对刺激的反应，其中基因数量占所有富集基因的30.22%。细胞成分类别中，其中更多的基因富集在细胞和膜类别中。分子功能类别，其中51个基因在分子功能分支中高度富集。

KEGG富集分析结果显示，217个DEG被分别富集到85个KEGG通路中。其中67.28%基因在代谢通路中富集，包括能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢等。此外，还富集到很多代谢途径，如ABC转运体、氧化磷酸化、光合作用，脂肪酸生物合成等等。

图4. 在硝酸盐上生长的铜绿假单胞菌中DEGs的聚类、GO网络分析和KEGG富集。

蓝藻含有吸收不同氮营养素的特定转运蛋白。编码ABC型硝酸盐/亚硝酸盐转运体的nrtABCD基因、编码铁氧还蛋白-亚硝酸盐还原酶的nirA基因、narB基因和铁氧还蛋白-硝酸还原酶基因的表达在硝酸盐环境下上调。这些基因通常存在于一个操纵子中，控制硝酸盐的吸收和同化。在氮的储存方面，生长在硝酸盐上的铜绿假单胞菌最为突出。该操纵子可能存在于铜绿假单胞菌中。然而，与聚球藻和鱼腥藻不同，在铜绿假单胞菌中未检测到glnK和nifI的表达，并且glnB的转录水平未发生差异性改变。铜绿假单胞菌PII及其编码基因的功能有待进一步研究。

当向绿脓杆菌提供硝酸盐时，光合作用相关基因的表达通常上调，与生长和生理变化一致。有趣的是，在铵胁迫下，铜绿假单胞菌光合作用不良的情况下，几个基因的表达显著上调。氨胁迫下，psbA基因的转录表达上调。psbA编码的D1蛋白是光介导的PSII损伤的主要靶点。因此，psbA的显著上调证实了P_n和Isat的变化所表明的结论，即充足的铵诱导光氧化PSII中的损坏。

RNA-seq结果显示，碳酸氢根转运蛋白和NdhF3~F4复合物，将细胞内CO₂转化为铵态氮，相关编码基因上调。这些基因负责CO₂ 蓝藻中依赖于光能的浓缩机制（CCM），因此，铜绿假单胞菌也通过CCM维持其光合作用中的能量平衡。

图5. 绿脓杆菌氮代谢和光合作用的分子调控网络。

sRNAs通过调控mRNAs的翻译和降解速率，在基因转录后调控中发挥着关键作用。为了更好地了解铜绿假单胞菌如何适应氮供应形式的变化，本研究确定了sRNAs及其靶点。结果表明，在硝酸盐和氨氮条件下培养的铜绿假单胞菌中检测到37个sRNA及其可能的靶蛋白编码基因的表达。然而，只有sRNA00003被注释为已知的蓝藻sRNA，即氮胁迫诱导的RNA 4（NsiR4）。近期有研究表明，NsiR4主要作为转录后调节因子，通过靶向编码GS失活因子7的gifA基因和编码含有DUF4090结构域的未知功能蛋白质的ssr1528基因，在GS的调节中发挥关键作用。然而，NsiR4对不同氮形态的反应目前尚不清楚。

对sRNA进行靶基因预测，并构建互作用网络。在4个sRNA（sRNA0004、sRNA0013、sRNA0022、sRNA0023）的目标中，超过20个。这些靶点涉及多种代谢途径，如氮的运输和储存、光合器官的组装、MC的产生、CO₂的固定。这些发现为进一步的研究奠定了坚实的基础，这将为蓝藻如何利用sRNAs整合多种调节途径以响应营养变化提供新的线索。

图6. 调节对氮形态变化适应的sRNA-靶基因相互作用网络图。