PCR实验也能翻车?这些方法来解决

2022-06-18 09:15:00 天根生化科技(北京)有限公司


6.14日  天气晴

小师妹一天心情实录

PCR 实验前

就这?这么简单的实验姐分分钟做完

做 PCR 实验中

姐就是女王,自信放光芒

电泳跑胶后

嗯?怎么什么条带都没有!除了 marker 还是 marker!

分析原因中

大意了!一定是有什么东西忘加了

再次 PCR 实验中

模板、引物、DNA 聚合酶、水,这回没错了!

电泳跑胶后

一整个大无语,跑胶还是没条带!实验女王重演翻车现场!


聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学的基础实验技术之一,但如果忽略了其中的一些要点,即使是实验室里的大神,也会遇到目的序列扩增不出的情况。PCR 的成功与否与模板、引物、DNA 聚合酶及其他反应组分、反应条件这四大要素紧密相关,今天我们就一起梳理下 PCR 失败的主要原因和对策吧!


PCR成功的四大要素及注意事项

1

模板(点击下方文字展开查看解决方案)

模板降解

  1. 尽量选择新鲜提取的模板进行 PCR 扩增,通过凝胶电泳检测模板的完整性,若降解严重需要重新制备模板;

  2. 模板避免反复冻融。

模板中含有DNA聚合酶活性抑制剂

  1. 采用离心柱法提取核酸,纯化模板,消除抑制剂的干扰;

  2. 适当减少模板量,采用梯度稀释摸索最佳模板量;

  3. 选用抗逆性强的 DNA 聚合酶。

模板量太低

  1. 适当增加模板量;

  2. 模板为 cDNA 时,选用目的基因表达量高的组织提取高质量 RNA 并选用基因克隆专用的反转录试剂盒得到的 cDNA 作为模板;

  3. 选用灵敏度高的 DNA 聚合酶。

高GC,复杂模板

  1. 使用 PCR 添加剂(比如 DMSO,甜菜碱)或 GC enhancer,促进高 GC,复杂序列模板双链解离从而有利于引物退火和序列延伸;

  2. 增加变性时间或温度,使 DNA 双链彻底解离;

  3. 选用适用于高 GC,复杂模板扩增的 DNA 聚合酶。

长片段

  1. 确保模板的完整性;

  2. 选择适用于长片段扩增的 Taq DNA 聚合酶或者超强高保真 DNA 聚合酶;

  3. 在试剂盒说明书建议的延伸速度基础上适当延长延伸时间;

  4. 采用抑制热交错 PCR(Suppression Thermo-Interlaced PCR, STI PCR)策略。

2

引物(点击下方文字展开查看解决方案)

引物降解

  1. 重新合成高质量引物,少量分装保存,防止多次冻融,避免长期置于冰箱冷藏部分。

引物设计不合理

  1. 建议使用引物设计软件(比如 Primer premier 6, Oligo 7 等)设计并选取评分较高的引物;

  2. 确保引物和模板结合的特异性。

3

DNA聚合酶及其他反应组分

(点击下方文字展开查看解决方案)

DNA聚合酶选择不合适

  1. 根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶,比如分子克隆实验中涉及到序列的高保真扩增,需要选择一款针对不同类型序列具有普适性的高保真酶。

DNA聚合酶活力下降

  1. 检查试剂是否过期,按照说明书要求合理保存试剂。

反应缓冲液体系与目的基因不匹配

  1. 不同目的 PCR 反应要求反应缓冲液中的镁离子、钾离子、铵离子、化学添加剂等成分浓度是不一样的,建议使用试剂盒中优化好的缓冲液体系。

4

反应条件(点击下方文字展开查看解决方案)

退火温度不合适

  1. 使用引物设计软件建议的退火温度,退火温度一般比引物的 Tm 值低 5 ℃;

  2. 不同的试剂盐离子浓度不同,最佳的退火温度可能存在差异,建议以软件建议退火温度为中心设置温度梯度,来获得最佳退火温度;

  3. 设置降落 PCR(Step-down)反应程序。

其他反应条件不合适

  1. 不同的 DNA 聚合酶试剂最佳反应条件是有差别的,选用试剂说明书建议的变性温度和时间,退火时间,延伸温度和速度,循环数。


可见在一个成功的 PCR 实验里,模板、引物、DNA 聚合酶、反应条件这四个要素缺一不可,尤其对于一些保真度要求高的长片段、或是一些高 GC 含量的复杂模板,选择一款合适的 DNA 聚合酶又起到至关重要的作用。


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  • 高保真性:为 Taq 聚合酶的 180 倍。

  • 模板普适性:能够识别不同物种、30%~80%GC含量的DNA片段。

  • 延伸力强:可扩增长至 20 kb 的 DNA 片段。

  • 高灵敏度:基因组模板用量可低至 1 ng。

  • 操作简便:只需加入模板和引物,轻松配好体系,PCR 产物平末端,纯化后可直接用于无缝克隆。

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以下为真实有效的实验案例

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1

不同的酶保真性比较

采用 KP213 和市场主流产品扩增 4kb DNA 片段(35 个循环),产物用 TIANGEN PCR-free 建库试剂盒进行建库,illumina 平台测 1G 数据量,后续根据各产品扩增碱基突变率得出产品的保真性。TIANGEN KP213 保真性可达 Taq 酶的 180 倍


2

普适性比较

使用不同高保真酶分别扩增不同来源、不同长度的片段。结果显示,KP213 在扩增能力、特异性、普适性、长片段扩增效率方面的综合性能表现优秀。

A: TIANGEN KP213; B: TY 公司高保真酶;C: K  公司高保真酶。模板上样量: 基因组 DNA, 200 ng; Lamda DNA, 50 ng。

M: TIANGEN D15000 Marker。1: 0.75 kb; 2: 1 kb; 3: 2 kb; 4: 3.9 kb; 5: 6 kb; 6: 0.48 kb (GC 75%); 7: 1.5 kb (GC 71%); 8: 2 kb; 9: 8.2 kb; 10: 2.3 kb; 11: 2 kb; 12: 3 kb; 13: 8.2 kb; 14: 8.1 kb; 15: 15 kb。


3

高低GC模板适应性

采用超强高保真酶 Ⅱ 扩增不同 GC 含量(30%~79%)的目的序列,都能得到特异性扩增产物。

M: TIANGEN DNA Marker Ⅳ。

1: 0.4 kb, GC 75%; 2: 0.7 kb, GC 30%; 3: 1.1 kb, GC 79%; 4: 1.5 kb, GC 71%; 5: 1.9 kb, GC 72%; 6: 2.4 kb, GC 35%; 7: 3.9 kb, GC 70%; 8: 4.1 kb, GC 65%。


4

长片段扩增能力

以水稻基因组和cDNA为模板,采用超强高保真酶Ⅱ扩增不同长度的目的序列,都能扩出目的产物。

M: TIANGEN D15000 Marker。 1-4: 模板为水稻基因组DNA; 5-7: 模板为水稻 cDNA。

1: 8.3 kb; 2: 13.3 kb; 3: 13.9 kb; 4: 16.5 kb; 5: 5.3 kb; 6: 6.5 kb; 7: 12.9 kb。



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 反馈结果 


声明

1. 首单特惠及赠礼每个课题组仅享受一次。

2. 有奖调研及首单赠送礼品将于2022年7月29日前发放,如果有退换货情况,首单赠品则退回或折价。

3. 反馈有礼结果提交截止至2022年9月2日。礼品将分批发放,第一批于2022年7月29日前发放完毕,第二批于2022年9月16日前发放完毕。

4. 活动参与方需确认未因法律法规或机关/ 机构政策的限制而不得参加活动或不得收受来自 TIANGEN 的礼品,活动参与方承诺其参与活动及提交的相关资料不会侵犯任何第三方的权利和利益,并使天根免于任何损失和责任。

5. 礼品兑换针对的是客户,而非客户工作人员。客户应对其工作人员领取礼品进行管理,客户工作人员个人领取礼品视为客户领取礼品,礼品所有权应归客户所有,因礼品领取及后续管理不善产生的和责任由客户承担。

6. 参与方应根据相关法律法规的规定就根据促销政策而兑换的所有礼品承担相应的纳税义务(若有)。

7. 宣传单中礼品图片版权归各品牌商所有。

8. 本次活动礼品赠送范围仅限科研客户,不包括临床诊断领域客户。

9. 本活动不与其他活动同享,天根生化科技(北京)有限公司享有对本活动的解释权。


参考文献

Zhao Z., Xie X., Liu W., Huang J., Tan J., Yu H., Zong W., Tang J., Zhao Y., Xue Y., Chu Z., Chen L., and Liu Y.-G. (2022). STI PCR: an efficient method for amplification and de novo synthesis of long DNA sequences. Mol. Plant. doi: https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.12.018.



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