【应用分享】亲和固相萃取结合高效体积排阻色谱法测定乳制品中的免疫球蛋白IgG

背景

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是具有抗体活性的动物蛋白，可分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。人体血清中免疫球蛋白的主要成分是IgG，它在人体内具有重要的免疫和生理调节功能，是人体内免疫系统中最为关键的组成物质之一。

目前，添加IgG的乳制品备受消费者的追捧，因乳制品成份较为复杂，若直接提取后使用液相色谱法进行测定，IgG受杂蛋白干扰较大，无法进行准确地定量和定性。参照GB/T 5009.194-2003，纳谱分析开发的整体解决方案，包括样品的前处理、样品的固相萃取净化、液相检测方法，使IgG实验操作简便高效、检测结果准确可靠。

适用范围

参照GB/T 5009.194-2003 保健食品中免疫球蛋白IgG的测定，创新地引入了固相萃取方法，优化了液相色谱方法。本方法适用于乳制品中免疫球蛋白IgG含量的测定。

实验步骤

01

试剂的准备

0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液：使用Na2HPO4和NaH2PO4进行配置；

冰乙酸溶液：准确吸取3 mL冰乙酸定容至1 L水中，再使用低浓度的NaOH溶液调节pH至3.0。

02

样品的制备

巴氏杀毒奶：准确称取试样2.0 g（精确至0.001 g），用0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液稀释至25 mL，摇匀，通过0.45 μm微孔滤膜后备用。

乳粉：准确称取试样0.1 g（精确至0.001 g），用0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液稀释至25 mL，摇匀，通过0.45 μm微孔滤膜后备用。

03

固相萃取方法

活化：SelectCore Protein G亲和柱，依次使用5.0 mL水、10.0 mL 0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液活化；

上样：取步骤2中制备好的巴氏杀毒奶溶液10 mL或乳粉5.0 mL上样至固相萃取柱上，弃去流出液；

淋洗：使用5.0 mL 0.05 mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲溶液淋洗，弃去淋洗液；

洗脱：用4 mL 冰乙酸溶液洗脱，收集全部洗脱液，并用冰乙酸溶液定容至5.0 mL，混匀；洗脱液直接使用高效液相色谱仪进行测定。

04

液相色谱仪器条件

Column：         BioCore SEC-300，5 μm

Dimension：     7.8×300 mm

Mobile Phase：150 mmol/L氯化钠溶于20 mmol/L PBS缓冲溶液中（pH7.0）

Flow rate：       0.5 mL/min

Temperature：  30 °C

Injection：       10 μL

Detection：      UV 214 nm

05

实验谱图

图1：200 μg/mL免疫球蛋白IgG标准品色谱图

图2：色谱柱残留色谱图

图3：巴氏杀毒奶样品色谱图

图4：巴氏杀毒奶样品加标（加标量：0.025 mg/g）色谱图

图5：乳粉样品色谱图

图6：乳粉样品加标（加标量：25 mg/g）色谱图

图7：巴氏杀毒奶样品未净化、净化处理对比色谱图

图8：乳粉样品经SelectCore Protein G亲和柱及其他厂家Protein G亲和柱净化对比色谱图

06

加标回收率

样品

加标量

加标回收率

巴氏杀毒奶

0.025 mg/g

105.39%

乳粉

25 mg/g

106.44%

实验结论

本文参照国标方法，选择亲和固相萃取净化结合高效体积排阻色谱法，有如下优势：

01

亲和固相萃取过程中可去除掉杂蛋白干扰，使得IgG的检测不受影响，从图7可以看出，未经净化处理的巴氏杀毒奶样品色谱图目标物附近基线波动很大，受基质干扰较强，目标物峰型较差，无法进行积分操作；从图8可以看出，相同的样品经其他厂家的Protein G亲和柱处理后，峰型虽然比未处理前有所改善，但是目标物周围的杂蛋白依旧存在干扰积分的现象。而经纳谱分析的SelectCore Protein G亲和柱净化处理后的样品目标物不受干扰，可准确进行积分操作；

02

亲和固相萃取方法可选择性富集IgG，保证了巴氏杀毒奶这种IgG含量较低的乳制品也能准确定量，并且回收率良好；

03

参考国标方法，对液相色谱分析条件也进行了优化，对于IgG这类的生物大分子，如果采用常规的反相色谱柱无法进行分析，因此选择了更加适合本项目的高效体积排阻SEC分析柱，实验过程中同时也验证了此款分析柱的残留性，在较高浓度的IgG标准品分析结束后，立即测试色谱柱中IgG的残留量，由图2的色谱图可以得知，几乎没有任何残留，保证了样品分析结果的真实可靠。

详细产品信息，欢迎选购：

产品描述

货号

SelectCore Protein G亲和柱 1mL; 10/pkg

PTG065-030001-1

BioCore SEC-300 5μm, 7.8×300mm

B213-050030-07830S