【应用分享】中药花椒的33种农残测定分析

2022-06-16 15:26:48

背景

自2020版中国药典四部2341农药残留量测定法中新增第五法，药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法，很多中药检测企业反馈含有挥发油成分较多品种基质效应较为严重，药典规定的四种前处理方法都难以解决。

纳谱分析根据挥发油成分特点，调整亲水亲脂聚乙烯吡咯烷酮填料技术参数，特别推出SelectCore HLB-A中药农残专用固相萃取柱（200mg/6mL）产品。相比市面上常规HLB产品，HLB-A可以吸附更多挥发油类成分，并且在除色效果上也较好，从而降低了基质效应。

★

适用范围

★

本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法方式二，适用于含挥发油和色素较多的中药材农残检测。

★

实验步骤

★

一、对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

精密量取禁用农药混合1 mL，置20 ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1 mL含0.1 μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0 mL(6份），置氮吹仪上，40 °C 水浴浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品溶液l0 μL、20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL，加乙腈稀释至l mL，涡旋混匀，即得。

二、供试品溶液的制备

2.1 提取

称取5 g花椒样品，加氯化钠1 g，加入50 mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50 mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5 mL，加乙腈定容至10 mL，摇匀，待净化。

三、净化

SPE柱：SelectCore HLB-A中药农残专用固相萃取柱（200mg/6mL）/ SelectCore HLB固相萃取柱（200mg/6mL）
净化：量取直接提取法制备的供试品溶液3 mL，过SelectCore HLB-A中药农残专用固相萃取柱，收集全部净化液，混匀，即得；（同法用SelectCore HLB固相萃取柱进行平行试验）
GC/MS/MS测定：取过固相萃取柱后溶液1 mL，加入0.3 mL内标溶液，混匀，过PTFE膜，上机分析。
LC/MS/MS测定：取过固相萃取柱后溶液1 mL，加入0.3 mL水，混匀，过PTFE膜，上机分析。

四、高效液相色谱-串联质谱法

（岛津 LC-MS 8050）

4.1 色谱条件

色谱柱：
ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100mm，2.6μm)
Agilent InfintyLab Poroshell 120 SB-C18(2.1 ×100mm，2.7μm)
流动相：
A：0.1%甲酸水溶液（含有5 mmol/L甲酸铵）
B：乙腈/0.1%甲酸水溶液（含有5 mmol/L甲酸铵）=95/5
梯度：

时间（min）	流速（mL/min）	流动相A （%）	流动相B （%）
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
12	0.3	0	100
14	0.3	0	100
14.1	0.3	70	30
16	0.3	70	30

流速: 0.3 mL/min
柱温: 40 ℃
进样量: 1 µL

4.2 质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描
监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）
离子源接口电压：4.5 kV
雾化气：氮气3.0 L/min
加热气：干燥空气10.0 L/min
DL温度：250 ℃
加热模块温度：400 ℃
接口温度：300 ℃
干燥气：N₂ 10 L/min

图1：ChromCore C18-MS Pesticides 色谱柱30种农药标准品（以甲胺磷计0.025 μg/ml）的典型谱图

图2：Agilent InfintyLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱30种农药标准品（以甲胺磷计0.025 μg/ml）的典型谱图

图3：花椒空白基质加标的典型谱图（SelectCore HLB净化）

图4：花椒空白基质加标的典型谱图（SelectCore HLB-A净化）

从以上花椒空白基质加标LC/MS/MS图对比来看，HLB-A可以有效减弱花椒样品的基质干扰，提高农残成分的灵敏度，让分析检测更为准确。

五、气相色谱-串联质谱法

（岛津 GC-MS 8030）

5.1色谱条件

色谱柱：DB-17MS，30m×0.25mm，0.25μm
进样口温度：250 ℃；
升温程序：初始温度为60 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升温至160 ℃；再以2 ℃/min升温至230 ℃，最后以15 ℃/min升温至300 ℃，保持6 min；
载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；
进样方式：不分流进样；
恒压模式：146 kPa；
进样量：1 μL。

5.2质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；
电离能量：70Ev；
传输线温度：250 ℃；
离子源温度：250 ℃；
监测方式：多反应检测模式（MRM）；
溶剂延迟：10.0 min。

图5：花椒空白基质加标的典型谱图（SelectCore HLB净化和SelectCore HLB-A净化对比）

表1 花椒中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

农残成分	回收率	农残成分	回收率
甲胺磷	90.6%	甲磺隆	88%
甲基对硫磷	77.3%	氯磺隆	81.8%
对硫磷	101.8%	胺苯磺隆	85%
久效磷	96.4%	甲拌磷	95.2%
磷胺	92.0%	甲拌磷砜	118.9%
α-六六六	88.4%	甲拌磷亚砜	103.1%
β-六六六	90.1%	甲基异柳磷	95.9%
γ-六六六	87.1%	内吸磷-O	84.5%
δ-六六六	72.6%	内吸磷-S	92.1%
2,4''-滴滴涕	61.8%	克百威	98.3%
4,4''-滴滴滴	69.6%	3-羟基克百威	104.8%
4,4''-滴滴涕	61.1%	涕灭威	76.7%
4,4''-滴滴伊	77.2%	涕灭威砜	97.3%
杀虫脒	88%	涕灭威亚砜	98.5%
除草醚	84.2%	灭线磷	90.3%
艾氏剂	72.8%	氯唑磷	88.2%
狄氏剂	66.2%	水胺硫磷	77.3%
苯线磷	100.0%	α-硫丹	69.8%
苯线磷砜	77.4%	β-硫丹	86.4%
苯线磷亚砜	96.3%	硫丹硫酸酯	84.6%
地虫硫磷	90.3%	氟虫腈	92.6%
硫线磷	91.5%	氟虫腈砜	89.0%
蝇毒磷	90.5%	氟虫腈亚砜	86.0%
治螟磷	97.4%	氟甲腈	104.8%
特丁硫磷	92.8%	o,p''-三氯杀螨醇	72.7%
特丁硫磷砜	102.9%	p,p''-三氯杀螨醇	65.4%
特丁硫磷亚砜	106.7%	硫环磷	94.3%
甲基硫环磷	91.3%

注：磺隆类、三氯杀螨醇农残用3ml供试品溶液净化时，回收率偏低，可以另取5ml供试品溶液净化，回收率可以满足药典要求。

六、处理后溶液的颜色比对

花椒提取液过HLB-A柱

花椒提取液过HLB柱

由上图可以看出，花椒提取液经过SelectCore HLB-A中药农残专用柱净化后样品颜色澄清透明，而常规HLB柱净化后样品颜色较深。

七、 HLB与HLB-A SPE柱的部分农残基质响应的区别

涕灭威

涕灭威砜

久效磷

甲基对硫磷

对硫磷

硫丹硫酸酯

蝇毒磷

八、实验讨论

通过以上实验数据比对，可以看出，SelectCore HLB-A中药农残专用固相萃取柱，针对花椒的挥发性成分和色素成分去除效果良好，这样，不仅保护了分析柱和离子源，还极大的消除了由于基质效应带来的检测灵敏度下降等问题。该方法不需要固相萃取柱活化步骤，提取液直接过柱就可以测定，其中普遍反映存在较大基质抑制效应的甲基对硫磷、对硫磷、硫丹硫酸酯、蝇毒磷等农残，回收率都得以保证，而针对磺隆类、三氯杀螨醇类农残用3mL花椒供试品溶液净化时，回收率偏低，可以另取5mL供试品溶液净化，回收率可以满足药典要求。并且，ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm，2.6 μm)针对中药农残各组分的峰型对称，灵敏度、柱效与其他知名品牌分析柱一样，保证了检测结果的准确性。

中药农残相关实验耗材：