自动化高通量平行层析法,加速早期纯化工艺开发

2022-05-30 19:05:40 帝肯(上海)实验器材有限公司


随着市场上新的生物药数量的不断增加,迫切需要高通量形式的高效工艺开发技术。如今,生物药的纯化仍以填充柱层析法为主,这不仅难度大耗时长,而且非常昂贵。OPUS RoboColumn技术是一种使用微型层析柱(MCCs)的填料筛选工具。它将传统层析法的填充床原理应用于微升规模。MCCs与自动液体处理系统并行运行,可以同时研究各种实验条件。这使得每次运行都能在较短的时间内获得更多的信息,而且所需的进料材料更少。MCC的应用广泛,包括样品制备、动态结合能力测定、建立淋洗方案和优化分步洗脱条件。


本文将为大家介绍如何在Tecan Freedom EVO液体处理平台上进行自动化填料筛选,以及使用拟线性梯度洗脱方法,对微型层析柱蛋白纯化工艺进行优化。基于离散化的概念,将线性梯度洗脱转化为多级梯度方案。文中研究了层析柱规格、流速、多级梯度洗脱和馏分收集对分离效率的影响,确定了实现层析柱高效性能的最佳参数设置。结果表明,采用微型化的自动层析方法不仅可以可靠地预测实验室规模的常规层析系统的分离性能,如ÄKTATM(Cytiva),还有助于加快填料筛选过程。

  实 验 流 程 

  • 自动化微型层析工艺平台的建立

使用Freedom EVO 200工作站,包含八通道液动机械臂、移板机械臂,Te-Chrom™ 模块、 梯度洗脱液收集的Te-Chrom Shuttle 模块,以及深孔板与紫外板的储存层架Hotel和储液槽、OPUS RoboColumn 层析柱等。整合Infinite®M200 PRO 对馏分定量测定并使用Magellan™ 软件进行分析。

图1:Freedom EVO 200工作站配备LiHa和RoMa Arms、Te-Chrom模块和Infinite M200 PRO酶标仪

  • 自动化微型层析平台的线性梯度模拟

使用Freedom EVO 的八通道液动机械臂(LiHa),以三种原始缓冲液为基础,在深孔板中配置盐浓度由低到高的梯度缓冲液。基于Evoware 软件的worklist 功能转化为工作站脚本。LiHa液动机械臂可同时平行制备8种洗脱液,并转移至微型层析柱MCCs。

 图2:多级梯度的定义

  • 使用Freedom EVO进行梯度洗脱

使用装载Eshmuno® CEX 填料的OPUS RoboColumns微型层析柱,5倍柱体积缓冲液平衡,2.6倍柱体积淋洗,除洗脱外,所有步骤的流速均为100cm/h,停留时间为1.8min。待纯化蛋白样本装载量为10mg/mL填料。使用Infinite M200 PRO 测定洗脱液的吸光值。

  • 使用ÄKTApurifier进行梯度洗脱

使用Superformance® 层析柱,待纯化蛋白样本装载量为10mg/mL填料。装载和再平衡期间的流速为150cm/h。以0-100%洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱。


结果与结论

  • 降低洗脱流速,可提高自动化微型层析的分离

    效率

使用柱床体积为600µl 的OPUS RoboColumns,获得高分辨率峰值,洗脱流速不应超过100cm/h,相当于最小停留时间1.8min。

图3:600µl OPUS RoboColumns在三种不同流速下的峰分离。蛋白质洗脱顺序:糜蛋白酶原A(1)、细胞色素C(2)、溶菌酶(3)

  • 洗脱梯度斜率变平,可提高自动化微型层析的分离效率

使用填料体积为600µl 的OPUS RoboColumns,洗脱流速为100cm/h,台阶高度10.4mm NaCl。馏分体积不大于300µl。

图4:梯度斜率对峰值分辨率的影响,使用600µl MCC在液体处理系统的拟线性梯度洗脱模式下运行。RS1/2指糜蛋白酶原A的分解.(1)以及细胞色素C(2)的分辨率,RS2/3是对细胞色素C(2)和溶菌酶(3)的分辨率。

  • Freedom EVO 自动化平台填料筛选所用时间远少于ÄKTA系统

比较Freedom EVO自动化液体处理系统结合OPUS Robocolumn层析柱的拟线性梯度洗脱方法,和ÄKTA系统进行填料筛选试验所用时间。结果显示,Freedom EVO自动化方案可在8小时内完成8种填料的测试,ÄKTA系统所需则超过24个小时。时间缩短最主要原因是Freedom EVO自动化平台可具有平行移液的能力,可同时处理8个微型层析柱。提高了实验通量,并减少待测蛋白样本的消耗。

图5:Freedom EVO和ÄKTA方法所需时间比较,使用的微型色谱柱内径为30x5 mm。

  • Freedom EVO 自动化平台的层析分离性能与ÄKTA系统相媲美

Freedom EVO自动化液体处理系统结合OPUS Robocolumn层析柱的层析分离性能,与ÄKTA系统非常相似,最大峰高的峰值分辨率和电导率值几乎相同。因此可用于可靠地预测大规模格式的蛋白质洗脱条件。

图6:使用Freedom EVO工作站结合装载Eshmuno®CEX 的OPUS RoboColumn层析柱(黑线)和装载Superformance层析柱的ÄKTA系统(红线)层析分离三元蛋白质混合物(层析柱规格均为 30 x 5 mm)。图中显示了280 nm的紫外吸光值和盐梯度。


Tecan 高通量蛋白纯化工艺自动化方案

  • 自动化、双平台,平行层析,加速进程


Tecan Freedom EVO高通量蛋白纯化工艺开发自动化平台


Tecan Fluent高通量蛋白纯化工艺开发自动化平台


  • 设备与模块

01

Fluent 自动化液体处理系统

  • 高通量和高性能,可处理96个样本,实现通道独立控制的最低流速

  • 高灵活度,配置不同模块,实现多种纯化方法

02

Freedom EVO 自动化液体处理系统

  • 定制化,蛋白纯化专用软件,实现简单运行和快速配置所需洗脱液

  • 高精准度和超高通量,多种整合和功能拓展

03

Te-Chrom with Shuttle模块

  • 高度可调,可适配多种洗脱液收集板

  • 两种类型可选,实现批次纯化或馏分收集

04

Infinite M200 PRO多功能酶标仪

  • 快速实现96个蛋白样本的紫外定量测定

  • 便于自动化整合

05

 Te-Stack™堆栈

  • 可存储最多50块微孔板

  • 可与自动化对接

06

Resolvex A200

  • 高通量自动加液,速度快,无吸头消耗

  • 正压系统,压力可调节,不易堵柱

07

Te-Chrom Wizard蛋白纯化定制软件

  • 图表化操作界面,可配置96中不同条件的缓冲液

  • 直观清晰,并可轻松从DOE软件导入

滑动查看更多


优势特性:

  • 微型化层析柱,节省填料、试剂成本

  • 高通量,可同时处理8个层析柱,最大处理96个

  • 线性流速,精准流速控制,最低流速可达8cm/h

  • 创新液动泵,实现8个通道8种不同平行流速独立控制

  • 简单易用,独特Te-Chrom Wizard,程序预设,只需6步就可完成

  • 核心模块,适于配制多种不同梯度条件,智能显示且自动报错

  • 馏分收集功能,结果可形成先进的色谱图谱,结果可直接对接AKTA

  • 全自动化,便于数据管理,减少人为误差或交叉污染


主要应用:

  • 结合载量确定

  • 纯化条件筛选

  • 填料筛选

  • 放大工艺验证

  • 蛋白/抗体纯化

  • AVV纯化


 最后,一起来看看Te-Chrom系统是

如何进行洗脱液和馏分收集的吧!


更多内容请关注:

lifesciences.tecan.com/applications_and_solutions/protein_science/protein_purification_and_bioprocessing

参考文献:

Kiesewetter A, Menstell P, Peeck LH, Stein A.《Development of pseudo-linear gradient elution for high- throughput resin selectivity screening in RoboColumn Format. Biotechnol Prog》。DOI号:10.1002/btpr.2363


衷心感谢André Kiesewetter为我们提供的数据和有趣的科学讨论

关于帝肯


帝肯(www.tecan.com)是在全球范围内提供生物制药、法医学和临床诊断实验室仪器和解决方案的供应商。公司专门从事生命科学领域实验室自动化工作流程解决方案的开发、生产和分销。其客户包括制药和生物技术公司、大学研究部门、法医和诊断实验室。作为一家原始设备制造商(OEM),帝肯也是开发和制造OEM仪器和部件的一员,然后由合作公司分销。公司于1980年在瑞士成立,在欧洲和北美均设有生产、研发基地,并在52个国家设有销售和服务网络。2020年,帝肯销售额为7.309亿瑞士法郎(约7.81亿美元)。帝肯集团的注册股份在瑞士六大交易所(TECN;ISIN CH0012100191)交易。


帝肯热线:4008 213 888

帝肯官网:www.tecan.com




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