这篇可复现性极强的单细胞+免疫治疗新思路,还不快拿走?!

2022-01-24 07:28:43, 九二行


白血病是一种严重的疾病,常用治疗方式包括化学疗法,放射疗法,靶向治疗,免疫治疗和骨髓移植,但是放射疗法和化学疗法对身体正常细胞伤害大,近几年出现的免疫疗法(基于嵌合抗原受体 (CAR)T细胞治疗)取得好的效果,但是长期暴露于肿瘤抗原后,免疫T细胞会出现功能衰竭的情况,导致免疫疗法效果不好。因此深入了解T细胞功能衰竭的细胞水平和分子水平上的变化,有助于检测患者免疫治疗状态,甚至辅助恢复耗竭性T细胞的功能。


那么,今天小编给大家介绍一篇发现在Advanced Science(IF 16.806)发表的一篇有关免疫学领域的好文,利用单细胞测序研究急性B淋巴细胞白血病中T细胞状态:“Single-Cell RNA-Seq of T Cells in B-ALL Patients Reveals an Exhausted Subset with Remarkable Heterogeneity”。这篇文章的关键在于利用单细胞测序技术发现了可能影响B淋巴细胞白血病治疗的耗竭性T细胞状态,并分析了基因水平的变化和细胞分化可能。





研究背景



急性淋B巴细胞白血病 (B-ALL) 是一种克隆性造血疾病,其特征是 B 淋巴祖细胞的异常增殖和积累。目前的化学疗法不可避免地损害正常细胞,并具有显著的长期毒性风险。在过去的十年中,出现了基于免疫的治疗方法,嵌合抗原受体 (CAR) 的 T 细胞在血液系统恶性肿瘤患者中好的效果。人们越来越意识到免疫微环境控制着免疫治疗后抗癌反应的强度,CAR-T细胞疗法的疗效在患者之间并不一致,并且与衍生T细胞的活性密切相关。因此,加深对抑制状态和患者体内 T 细胞功能异质性的理解对于揭示新的治疗靶点至关重要。





研究思路







研究结果



1.在B-ALL 患者中特异性识别出两个耗竭性T细胞亚群

为了研究B-ALL患者的T细胞免疫状态,作者收集来自两名健康个体和三名未接受过治疗的 B-ALL 患者的外周血样本,然后使用荧光激活细胞分选 (FACS) 纯化的 CD45 + CD3 +细胞群进行 scRNA-seq 和 TCR 测序,使用 10 × 基因组学平台进行测序(图 1A)。经过质量控制,分别保留健康状态和 B-ALL 状态下的 12 669 和 16 143 个 T 细胞的转录组图谱,其中 3586 个和 14 550 个细胞具有配对的 TCR 克隆型,平均而言,在单个 T 细胞中检测到 1590 个基因和 5439 个独特的分子标识符 (UMI)。无监督聚类分析将单个T细胞分为健康个体的11个亚群和B-ALL患者的13个亚群。通过细胞特征基因marker对这些亚群进行注释,并使用 “SingleR”和参考数据集进一步确认(图1BC)。通过细胞特征基因marker分别把细胞注释成幼稚CD4 + T 细胞 (CD4_Naïve),幼稚 CD8 + T 细胞 (CD8_Naïve)),其特征是SELL、TGF7CCR7LEF1的高表达。中央记忆 T 细胞 (CD8_CM)、终末效应 T 细胞 (CD4_TE 和 CD8_TE) 和效应记忆 T 细胞 (CD8_EM)中与细胞状态相关的基因表达水平低,细胞毒性标志基因(NKG7GNLYPRF1GZMKGZMH)在 CD4_TE 和 CD8_TE 中较高。黏膜相关恒定性T细胞(MAIT) 的特征是TRAV1-2和SLC4A10、RORC和ZBTB16 的特异性表达。γδ T_GZMK +γδ T_GZMK 的特征是TRDCTRDV2KLRC2GZMK。Treg 细胞的特征是Foxp3、IKZF2、IL2RA和CTLA4 的高表达以及共刺激标记物CD28和ICOS。作者在 B-ALL 患者中显示了两个耗竭性 T 细胞亚群(CD4_Exhau 和 CD8_Exhau),其特征在于耗竭标志物LAG3、PDCD1、TIGIT和HAVCR2 的表达水平高(图 1C)。11 个 T 细胞亚群在健康和 B-ALL 样本中都稳定表达,两个耗竭性T 细胞亚群是患者特异性(图 1D)。作者再通过 Pearson 相关性分析分别分析健康个体和B-ALL中 T 细胞亚群之间的关系(图 1E),结果发现幼稚性、效应性和耗竭性 T 细胞亚型聚集在一起,Th和Treg细胞聚集在一起。在 B-ALL 患者中,两个耗竭性T细胞亚群(CD4_Exhau 和CD8_Exhau)明显聚集在一起。


这篇文章的关键在于研究人员通过单细胞分析数据的无监督聚类得到了耗竭性T细胞,并且具有明显的异质性。


2.在B-ALL中不同T细胞亚群表现不同的增殖特性

接下来,作者对来自健康人和 B-ALL 患者的所有T细胞数据整合,其中,在健康人中鉴定的11个T细胞亚群,这些亚群与 B-ALL 患者中的相应亚群聚集在一起(图 2A)。通过配对Pearson 相关分析表明,两种条件下配对的 T 细胞亚群具有相似的表达模式,但耗竭 T 细胞亚群除外(图2B)。作者继续分析健康个体和B-ALL中T细胞的增殖情况,目前的细胞周期包括G1(DNA合成前期),S(DNA合成期),G2(DNA合成后期),M期(细胞分裂期)。通过细胞周期评分,发现B-ALL患者中,T 细胞大部分保持G0/G1 状态,一部分 T 细胞(≈20.4%)处于S或G2/M期,其中耗竭性T细胞亚群(CD4_Exhau 和 CD8_Exhau)是增殖率最高的种群(分别为 41.7% 和 31.1%)(图 2C),这表明耗竭性 T 细胞是主要的增殖细胞。紧接着,作者从转录组层面对白血病患者与健康个体(除去耗竭性T细胞)比较每个亚群中的差异表达基因(DEG),然后对DEG进行基因功能富集分析,结果发现大多数上调基因在T细胞亚群中共享(图 2D)。上调基因功能包括抗原呈递( HLA-DQA1和HLA-DQB1),T细胞活化(CD27和CTLA4),细胞毒性(GNLY和GZMB),癌基因激活(RHOA和CBLB),以及细胞因子介导的信号传导通路(IL2RG和IL7R)(图 2E)。最显著下调途径参与核糖体大亚基的合成(RPLS和RPSS)和缺氧反应(CYBA和ND4)(图 2F)。B-ALL 中的 T 细胞被广泛激活,这结果表明,白血病状态的 T 细胞抗原呈递和免疫毒性功能上调用于去除白血病细胞。作者通过比较健康人群和B-ALL的T细胞亚群的增殖情况,发现耗竭性T细胞的增殖多,通过对非耗竭性T细胞在健康人和B-ALL之间的差异基因分析以及功能富集分析,结果发现B-ALL中T细胞功能明显激活。


这里,作者通过细胞相关性分析,细胞增殖情况,差异基因表达分析,基因功能分析,发现健康人和B-ALL中相同细胞的表达模式相似,与健康人相比, B-ALL中耗竭性T细胞的增殖高,非耗竭性T细胞的抗原呈递、活化、细胞毒性等各项功能被激活上调表达。


3.B-ALL患者中耗竭性T细胞内部的转录组异质性

作者进一步研究耗竭性T细胞本身的性质,通过无监督聚类把耗竭性CD4/CD8 T细胞分成10个细胞亚群(图 3A。这些细胞亚群的耗竭基因表达水平不同,并且具有不同的表达模式,分别与细胞周期状态、幼稚状态或GNLY(颗粒融素)表达相关(图3B、3C、3D)。相比于非耗竭性T细胞亚群,所有耗竭性T细胞亚群明显表现出更高的耗竭分数。Ex_CCR7+Ex_cc_CCR7+表现出更高的幼稚分数和相对较低的细胞毒性分数。然后,作者将耗竭性 CD8 + T细胞亚群与CD8_Naive、CD8_EM、CD8_CM 和 CD8_TE 细胞亚群比较,将耗竭性CD4 + T 细胞亚群与 CD4_Naive、CD4_Th、CD4_Treg 和 CD4_TE 细胞亚群进行比较,取交集获得28个耗竭特异性基因的列表(图3E)。已知的耗竭性标记,包括HAVCR2、PDCD1、LAG3和HLA-DRA,都在排名靠前的基因中。 基因列表中还包含几个较少描述的基因,包括CXCR6、ITM2A、SH2D1A、CD38、CBLB和TIMD4(图 3F)。而根据癌症基因组图谱急性髓系白血病 (AML) 数据 ( https://www.cancer.gov ),CXCR6、CD38和CBLB 的高表达与不良预后相关。最近的报道表明,ITM2A 的高表达与卵巢癌的不良预后相关,而TIMD4可能为提高癌症免疫治疗的临床疗效提供一种新的策略。因此,作者的研究不仅证实了先前确定的基因与衰竭的 T 细胞有关,而且还确定了可以用于诊断和免疫治疗的潜在生物标志物。


此处,作者在深入研究耗竭性T细胞内部的转录组异质性,获得表征耗竭性的基因标志。


4.TCR库表明 B-ALL患者T细胞存在广泛的状态转化

接下来作者对B-ALL中T细胞TCR克隆情况进行分析。通过Pearson相关分析评估每个亚群中克隆型组合之间的关系(图 4F)。发现四个耗竭性CD4 +亚群聚集在一起,四个耗竭性CD8 +亚群也聚集在一起,表明这些细胞亚群具有相似的TCR特征。作者比较克隆扩增的 T 细胞和非克隆 T 细胞之间基因表达差异,结果发现克隆扩增的细胞大多高表达细胞毒性效应分子, 如颗粒酶B和H(GZMB和GZMH),FGFBP2,GNLY,NKG7,KLRD1,和趋化因子(CCL5)(图 4B、4C)。Metascape基因富集分析表明,这些克隆扩增细胞更多地参与抗原加工和呈递、淋巴细胞活化、免疫反应和细胞防御途径(图 4D)。作者通过确定不同T细胞亚群的扩增细胞比例,发现CD8_CM、Th 和 Treg 簇亚群克隆扩增最少,CD4_TE、MAIT、CD8_TE、CD8_EM 和耗竭性细胞亚群克隆扩增高(图 4E)。作者通过Pearson相关分析各细胞亚群之间的关系,结果发现四个耗竭性CD4+T细胞聚集在一起,四个耗竭性CD8+T细胞也聚集在一起,表明各耗竭性T细胞具有相似的TCR特征。通过热图分析发现CD8_EM和CD8_TE细胞亚群与耗竭性CD8 +T细胞共享更多的克隆型亚群,而其它的 T 细胞亚群共享有限的 TCR(图 4G),作者的结果表明不同的 T细胞亚群绝不是完全孤立的,它们可能会经历广泛的细胞转换。此外,作者推测耗竭性CD8 +亚群、CD8_TE和CD8_EM具有相同的来源。


在这里,作者通过TCR测序结果确定B-ALL中TCR克隆扩增情况,发现克隆扩增的细胞大多表达细胞毒性效应分子,同时CD8+耗竭性T细胞可能来源于CD8_EM和CD8_TE。





研究结论



这篇文章首先是通过细胞聚类注释得到健康人和正常人的细胞亚群,关键是发现了两种耗竭性T细胞,接下来就是健康人和正常人细胞亚群相关性的比较,增殖水平和基因功能的分析,再深入一点是对耗竭性T细胞异质性的分析,并确定了耗竭性基因标志物,最后是通过常规的TCR测序分析发现T细胞可能的转化路径。


作者的这项研究揭示了B-ALL中T细胞在聚类、活性和基因特征方面的特征,通过无监督聚类并通过特征基因注释细胞亚群发现CD4_exhaust和CD8_exhaust两种耗竭性T 细胞,然后作者对B-ALL中的T细胞所处的细胞周期状态进行分析,结果发现健康人的T细胞大多处于G0/G1期,细胞并没有处于增殖活跃的状态,但是B-ALL中T细胞增殖率高,这也是符合预期认知的,在肿瘤环境下免疫系统被激发,T细胞大量增殖。通过比较健康人和B-ALL的基因功能,结果发现B-ALL与抗原提呈,活化,细胞毒性相关基因被广泛激活,这也是符合预期认知。作者还比较健康人与B-ALL的相同类型T细胞之间是否存在基因表达模式上的差异,结果发现两组之间的表达模式相似,并没有很明显的差异,除了B-ALL存在耗竭性T细胞外。

对两类耗竭性T细胞进行深入探究,发现耗竭性T细胞内部仍然存在异质性,这种异质性表现在细胞周期状态、幼稚状态或GNLY,这表明多种不同状态的耗竭性T细胞参与到免疫反应中。通过与其它非耗竭性T细胞比较,发现表征耗竭性T细胞耗竭状态的特异性基因,这个耗竭性基因标志也可以作为指标检测免疫治疗效果

通过TCR测序进一步了解B-ALL中T细胞的克隆扩增和共享情况,结果发现CD8+耗竭性T细胞可能来源于CD8_EM和CD8_TE,通过增强CD8_EM和CD8_TE杀伤肿瘤细胞的能力,是否可以提高免疫治疗效率

这篇文章有助于我们了解B-ALL中T细胞耗竭机制。如何减少B-ALL中T免疫细胞耗竭导致的功能障碍对于B-ALL是一种具有潜力的治疗思路。


END



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