低聚核酸的LC/MS检测

低聚DNA 20mer的分析

1-1.流动相条件的探讨

流动相A除了甲酸铵水溶液之外，还测试了超纯水、碳酸氢铵水溶液、氨水等，只有使用甲酸铵水溶液时低聚DNA才能被保留，所以流动相A选择为甲酸铵水溶液。

下图为改变流动相A的甲酸铵浓度和A/B混合比例时样品1（2.2mg/mL）的UV色谱图比较。流动相A的盐浓度为100mM，流动相B为57%的等度条件下，主要成分20mer的低聚DNA在15min附近被检出，在此之前19mer更小的低聚DNA按照聚合度较低的顺序洗脱，这在MS谱图中得到了验证。聚合度高的部分亲水性也高，推测是HILIC的分离模式在起作用。然而，这在短链低聚DNA分离上不够充分。

因此，研究了梯度分离条件。流动相B的比例一开始为62%，在分析开始后的10min内降至56%，在56%处持续10min，分离效果和分离时间能达到最好的平衡。为了提高MS的高灵敏度，流动相的盐浓度越低越好，把流动相A的甲酸铵浓度下降到50mM、20mM，50mM的浓度对分离效果几乎不产生影响，20mM浓度的时候有一部分峰型变差。所以，甲酸铵水溶液的浓度选择50mM。注意，使流动相恢复初始的平衡状态需要5min。

1-2.样品1和2的LC/UV/ESI-MS分析

下图是样品1和2（分别1mg/mL）的UV色谱（260nm）的比较。初始流动相B的比例为62%，在分析开始后的10min内降到56%，维持10min后再恢复成62%。含有G的样品的的保留有增强倾向。因为DNA链形成双链时，G和C形成了比A和T更强的碱基对。G和填料中的氢键的结合可能也与保留有关。

下图为样品1 20mer的低聚DNA的光谱（-）。低聚DNA被检测为多个质子脱落的多价负能量离子。

*分析条件参考上图。

样品1和2的MS谱图如下。经确认，在任何一种样品中，各链长的低聚DNA都是按照聚合度从小到大的顺序被洗脱。UV谱图中存在分离不充分的部分（11mer和12mer，18mer和19mer），在MS下可以个别检测。

*分析条件参考上图。

样品1 20mer的低聚DNA的MS谱图和检量线请参考下图。为了缩短分析时间，在梯度条件下，流动相B的初始浓度为60%，在分析开始后的10分钟下降到55%，并保持5min。检量线的线性良好，SIM模式下在10μg/mL的水平下可以进行高选择性定量。如果进一步降低乙腈的比例，还可以再缩短分析时间。