Molecular Psychiatry:蛋白组学+磷酸化蛋白组学揭示早发遗传性癫痫的神经元网络变化和治疗药物

2021-11-18 17:46:31, XHL 上海吉凯基因医学科技股份有限公司


早发性癫痫病是一种严重的疾病,通常与特定的基因突变有关。其中,CDKL5缺乏症(CDD)是一种神经发育疾病,其特征是早发性癫痫发作、智力延迟和运动功能障碍。尽管对大脑正常发育至关重要,但CDKL5的确切靶点及其与患者症状的关系仍不清楚。


美国的多个研究机构合作在《Molecular Psychiatry》(中科院JCR一区,IF:15.992)上发表了题为“Altered network and rescue of human neurons derived from individuals with early-onset genetic epilepsy”的研究论文。文章利用基于质谱的蛋白组学和磷酸化蛋白组学检测了缺乏CDKL5蛋白的经过诱导分化的神经细胞的异常蛋白表达变化和磷酸化变化。通过高通量药物筛选平台选中几种药物可以挽救CDD异常的神经网络。总体的研究,揭示了遗传性癫痫的细胞、分子和神经网络机制,最终可能为患者带来新的治疗机会。

 

实验设计

蛋白组学和磷酸化蛋白组学的样本:神经组细胞(NPC)、皮质类器官、神经元细胞及各自的对照组样本。


详情:6个CDD(CDKL5缺乏症)患者(5种独特的CDKL5突变)来源的皮肤成纤维细胞及对照组细胞先诱导产生诱导多能肝细胞(iPSC),随后iPSC诱导分化为神经组细胞(NPC)或3D培养为皮质类器官(cortical organoid),NPC细胞再进一步分化为神经元。

 

研究结果

  • 神经祖细胞(NPC)蛋白组学和磷酸化蛋白组学结果


蛋白组学定量了6505种蛋白质,下调的蛋白质富集在基于微管的过程(23种蛋白质)。差异蛋白的IPA分析表明CDD的细胞活力和神经元发育受损。通过评估体外细胞数量随时间的变化,作者观察到,与对照组相比,CDD神经干细胞增殖缓慢,同时也发现了细胞周期的改变。此外,还观察到了DNA断裂、线粒体去极化和caspase活性的增加,提示细胞死亡的增加。



  • 磷酸化蛋白质组学揭示CDD神经元发育和mTOR激活的变化


在神经元中,共鉴定并量化了来自于1485种蛋白质的4115个磷酸化肽段。在皮质类器官中,共鉴定并量化了来自于2212种蛋白质的6769种磷酸化肽段。上调的磷酸化肽段的motif分析观察到了pSXXE过度表达,该位点可被嗜酸激酶如CK2磷酸化。IPA分析和激酶富集分析显示,已知被CK2磷酸化的蛋白在CDD神经元中增加,表明CK2被过度激活。磷酸化蛋白质组分析同时揭示了CDD神经元和类器官中的几种失调的磷酸化蛋白,如微管相关蛋白、脑衰反应调节蛋白家族蛋白以及细胞骨架组织蛋白。总体上,神经元和类器官的磷酸化蛋白富集在神经发生、形态学、迁移、突触发生和神经传递等条目。此外,在神经元的磷酸化蛋白质组学分析中发现了mTORC1通路的富集。mTORC1通路的激活也通过氨基酸饥饿实验被证实。



  •  CDD神经元表现出形态学异常和迁移受损

细胞骨架蛋白在结构上支持神经元的树突和轴突,并在神经元的形态发生、可塑性和迁移中发挥重要作用。此前的蛋白质组学提示了神经元存在细胞骨架的改变,因此作者测量了神经元突起的生长和嵴样变化。作者注意到CDD神经元的嵴样运动明显减少,而嵴样密度增加。这些细胞观察结果与微管动力学和细胞骨架组织的变化一致。


将CDD神经祖细胞(NPC)和标记的神经元分别移植到新生小鼠的大脑中,在移植的CDD神经元中发现树突状长度显著增加,这与体外CDD神经元的形态学改变一致。死亡患者脑组织神经元形态与对照组的差异在不同的皮质区域会有不同,也和人的发育阶段密切相关。此外,皮质类器官培养的实验中发现,与对照组相比,CDD细胞增殖和迁移的改变导致了更小的皮质类器官和迁移缺陷。

 

 

  • CDKL5缺失影响突触发生,促进早期网络的过度兴奋性

接下来,作者研究了在CDD中发现的细胞和分子改变将如何影响神经元功能和网络形成。WB检测到突触前和突触后蛋白标记物的表达下降。作者检测了CDD和对照皮质类器官的蛋白质表达,共发现15种谷氨酸能突触结合蛋白的动态蛋白共关联存在显著变化。同时还观察到CDD神经元下游突触蛋白网络的广泛变化,这可能与神经网络的形成有关。进一步研究发现了CDD皮质神经元Na+和K+通道的过度兴奋和功能障碍。此外,作者观察到在CDD神经元网络发育的早期阶段,峰值频率显著增加和神经元网络过度同步。

 


  • 高通量药物筛选平台寻找能够挽救CDD功能的药物

作者通过一个高通量药物筛选平台寻找可以还原CDD神经网络兴奋性的药物。最终研究者发现四种化学物质:超极化激活的环核苷酸门控通道封闭剂Ivabradine、毒蕈碱受体抑制剂Solifenacin、GSK3抑制剂和Notch抑制剂Crenigacestat能够挽救CDD向外径的细胞迁移缺陷。总之,该高通量药物平台发现了新的化合物,或可用于治疗CDD和其他类型的难治性癫痫综合征。


研究总结

作者通过蛋白组学和磷酸化蛋白组学揭示了CDKL5缺乏症(CDD)脑细胞中受CDKL5突变影响的潜在下游分子和通路,并描述了与分子改变相关的细胞和功能表型。同时,通过高通量药物筛选平台,寻找到了4种药物可以挽救CDD异常的功能,这为CDD患者和其他难治性癫痫综合征提供了新的治疗机会。

 

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