恒光讲堂｜聚集诱导磷光在第二近红外窗口中的成像

2021-11-17 19:00:23, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：第二近红外窗口(NIR-II，1000-1700 nm)的荧光成像是一种非常有前途和研究活跃的技术，而利用NIR-II磷光进行光学成像的研究还很少。本文报道了一种聚集诱导的选择性信号激活策略，该策略依赖于探针的辐射模式从弱荧光转换为强NIR-II磷光。铜铟硒(Cu-In-Se)量子点在孤立状态下发出极弱的荧光，其聚集态在≈1045 nm处显著发光，发光寿命提高了2.7×103倍以上。用介孔二氧化硅纳米颗粒(Cu-In-Se@MSN)包裹Cu-In-Se组装，证实了聚集诱导的发射模式转换，显示出独特的磷光型发射。NIR-II磷光信号使Cu-In-Se@MSN显示出令人印象深刻的寿命成像，并且可以准确地确定血管的高阶分支。对辐射模式转换起源的研究不仅为理解光物理过程提供了新的视角，而且可能为设计智能NIR-II探头奠定基础。

方案1：聚集驱动的长寿命NIR-II磷光的示意图.Cu-In-Se量子点在水中有很微弱的荧光，但聚集后在≈1045 nm处有很强的磷光发射，寿命长

在这项工作中，将亲水性的非发光铜铟硒(Cu-In-Se)量子点转换为高发光的Cu-In-Se聚集体，可以发射以≈1045 nm为中心的近红外-II信号(方案1)。具有“开关”功能的NIR-II无机量子点以前没有报道过。机理研究表明，AIE型Cu-In-Se量子点的荧光红移归因于主导辐射模式从微弱荧光向明亮磷光的转变。此外，发展的近红外第二代磷光成像是成像方式的研究前沿，通过最小化纳秒级寿命的背景干扰，为高质量成像提供了多种强大的技术。NIR-II磷光成像拥有巨大的潜力，可以在没有噪音的情况下专门监测目标的清晰和深度。

图1：Cu-In-Se量子点的结构表征a)溶剂诱导Cu-In-Se量子点的可逆聚集过程方案b-f)Cu-In-Se量子点在b-d)水和e，f)乙醇中的代表性TEM和AFM图像g)Cu-In-Se量子点的HAADF-STEM图像和相应的EDS元素映射

首先，透射电子显微镜(TEM)图像(图1b)和相应的尺寸分布直方图均显示所制备的Cu-In-Se量子点为球形，平均尺寸为4.6±0.8 nm。每个Cu-In-Se量子点在水中都表现出良好的单分散性。Cu-In-Se量子点可以被鉴定为CuInSe_2-In2Se。原子力显微镜(AFM)图像直接证实了Cu-In-Se量子点的优势直径小于5 nm(图1D)，这与TEM分析一致。在添加乙醇或甲醇后，亲水性的Cu-In-Se量子点会降低Cu-In-Se量子点的表面电荷，从而使这些量子点失去足够的胶体稳定性。

从图1e，f中的全景透射电镜图像可以看出，以乙醇为溶剂产生了大量的聚集体，而放大的透射电镜图像表明，这些聚集体实际上是由定义良好的球形Cu-In-Se量子点填充的。以上分析证实，由于随机聚集事件的存在，Cu-In-Se量子点的排列趋于不规则。重要的是，聚集的程度与Cu-In-Se量子点的发光类型(荧光或磷光，见下文)密切相关。为了进一步研究得到的Cu-InSe量子点的化学成分和微观结构，进行了高角度环形暗场扫描透射电镜(HAADF-STEM)(图1g)。元素分布图清楚地支持了Cu信号与Se信号共位，并与In信号部分分离。这与高分辨率TEM图像的观察结果一致(图1c)。

图2：Cu-In-Se量子点对溶剂变化的长寿命磷光响应.A)基于强度的NIR-II成像系统方案.B)近红外图像C)发射光谱和D)含不同体积分数乙醇的水/乙醇混合物中Cu In Se量子点的相应发射图谱.E)Cu-In-Se量子点的光致发光峰(950和1045 nm)强度与乙醇体积分数的关系图.F)分散在80%乙醇中的Cu-In-Se量子点的光致发光衰减曲线G)Cu-In-Se量子点在50%乙醇(顶板)和95%(底板)乙醇中的光致发光激发图谱和H)依赖于激发的发射光谱.I)Cu-In-Se量子点在50%乙醇中的浓度依赖发射光谱

其次，在水中得到的Cu-In-Se量子点显示出非常弱的PL响应(图2a-d和表1)，这主要归因于非辐射跃迁事件的存在。Cu-In-Se量子点以孤立物种的形式溶解(图1b)，这可能导致它们的分子扭转、振动和旋转运动受到限制，从而猝灭了发射效率。然而，在Cu-In-Se量子点表现出相对较差稳定性的乙醇中(图1e)，可以观察到发射强度和量子产率(表1)的显著增强，这取决于乙醇在水中的体积分数。结合TEM和NIR-II成像的测量结果，Cu-In-Se量子点的聚集体越致密，发光越强，表现为典型的易自组装的AIE现象。光致发光曲线逐渐分裂成双峰型：以≈1045 nm为中心的新的≈-II发光带和以水为中心的950 nm处的原始发光带一起出现。

为了进一步研究上述光物理结果，808 nm的激发下，在Cu-In-Se量子点上进行了映射(图2d)，显示出荧光强度的显著增加，随着乙醇体积分数的增加，最亮的区域单调地移动到更长的波长，≈1045 nm处的近红外-II发射信号呈指数增强，而≈950 nm荧光带变弱，最终几乎整合到新生成的近红外-II带中(图2C)。相反，在≈1042 nm处(例如，在80%乙醇中的Cu-In-Se量子点)的近红外-II发射呈三倍指数衰减，寿命为143.1µs，对应于慢得多的发射过程。Cu-In-Se量子点比先前存在的铜硫化物纳米晶和金属(Au，Ag，Pt等)具有显著的近红外-II寿命优势。此外，在≈950nm处极弱且寿命极短的荧光信号表现出荧光性质，这是由不同种类的孤立或松散组装的Cu-In-Se量子点产生的。

表1：Cu-In-Se量子点的荧光光谱结果

图3：Cu-In-Se量子点聚集时发出强而长寿命的近红外-II磷光的可能机制.A)提出了分散态和聚集态Cu-In-Se量子点的能级结构.B)Cu-In-Se量子点的球差校正HAADF-STEM图像.箭头代表的是富In缺陷区，这也是Cu-In-Se量子点的卡通图片

接着，为了进一步验证Cu-In-Se量子点组装的堆积程度是否对发射模式的改变有很大的影响，对分散在不同条件下的Cu-In-Se量子点进行了PL激发映射研究(图2g)。在50%的乙醇中，当激发波长从650nm到808nm时，Cu-In-Se量子点的光致发光带从≈850红移到1050 nm以上，这清楚地表明了不同发光物种的存在。这种独特的性质将使Cu-In-Se量子点在生物成像方面非常有用，短波吸收和散射的干扰最小。

与浓度相关的发射光谱也支持能够诱导弱荧光转换为明亮磷光的聚集事件(图2I)。然而，随着Cu-In-Se量子点浓度的不断提高，在≈1045nm处出现了新的≈-II发光峰，而原来的NIR-II发光峰基本保持了其发射强度。尽管溶液在高浓度的Cu-In-Se量子点下仍保持均匀，但DLS测得的流体力学尺寸增加到≈200 nm，显示出纳米级聚集体的形成。上述观察结果明确地表明，发光方式的改变与聚集的Cu-In-Se量子点的堆积程度有关。这种AIE参与的方案可能是一个因素，可以解释存在于Cu-In-Se量子点溶液或其固体粉末中的磷光荧光发射的产生(表1)。接下来进行了微结构表征，以确定Cu-In-Se量子点中缺陷相关发射信号的可行性。球差校正的HAADF-STEM验证了发育良好的晶体CuInSe2基质(图3b)中富In缺陷的存在，这与高分辨率TEM结果(图1c)证明的CuInSe2-In2Se3异二聚体组成一致。

图4：基于所制备的Cu-In-Se量子点的长寿命NIR-II磷光探针的设计.A)介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)包覆Cu-In-Se量子点的合成工艺示意图.B)分别用5 mg和50 mg Cu-In-Se量子点制备的Cu-In-Se@MSN-1和C)Cu-In-Se@MSN-2 ,D)Cu-In-Se@MSN-2的HAADF-STEM图像和相应的EDS元素映射.E)分散在水中的Cu-In-Se@MSN-2的激发相关发射光谱.F)分别在1041 nm和1060 nm处测量了Cu-In-Se@MSN-1和Cu-In-Se@MSN-2的光致发光衰减曲线.G)时间分辨近红外-II成像系统和分散在不同体积分数乙醇和Cu-In-Se@MSN-1/2纳米复合材料中的Cu-In-Se量子点的寿命图像

然后，为了进一步验证聚集度对发光性质的影响，尝试固定了Cu-In-Se组装的结构。如图4a所示，通过将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)吸附到Cu-In-Se量子点的外表面，这种纳米晶体可以从负电荷转移到正电荷。二氧化硅前驱体(如正硅酸乙酯)水解、缩合，最终生成核壳结构纳米复合材料(命名为Cu-In-Se@MSN)。Cu-In-Se@MSN-1和Cu-In-Se@MSN-2样品均呈分散、均匀的球形，TEM尺寸(110±20 nm)无明显差异。在每种纳米复合材料中都有明显的深色核存在，表明Cu-In-Se量子点被成功地包裹在介孔二氧化硅基质中，这表明Cu-In-Se量子点被成功地包裹在介孔二氧化硅基质中。HAADF图和相应的元素图谱表明，大部分Cu-InSe@MSN-2具有核@壳结构(图4d)。综上所述，与广泛认可的疏溶剂相互作用控制的聚集形成鲜明对比的是，这里开发的耦合两步序列方法(即量子点和二氧化硅涂层的自组装)能够同时执行以下功能。首先，CTAB介导的自组装使得Cu-In-Se量子点具有较高的聚集程度。其次，二氧化硅包覆步骤可以进一步将单个Cu-In-Se量子点紧密地包裹在一起，避免致密排列的崩塌。以上结果表明Cu-In-Se@MSN量子点聚集体的尺寸分布相对均匀。此外，Cu-In-Se@msn-2的寿命高达783.2µs(图4f)。在水和95%乙醇中分别是原始Cu-In-Se量子点的1.3×105和4.8倍以上(表1)。Cu-In-Se量子点的长寿命衰减在很大程度上归因于大量的Cu-In-Se量子点的紧密排列，它通过限制覆盖配体的振动和旋转，同时阻止了非辐射路径，并激活了辐射衰减路径。

Cu-In-Se量子点在80%或更多乙醇中的寿命成像可以很容易地识别背景信号，并具有一致的伪色，这表明长寿命近红外-II磷光具有很高的可靠性。时间分辨NIR-II成像数据验证了长寿命NIR-II磷光可以作为一种非常有用的工具来提高成像的准确度和精确度。基于Rose标准，抗光漂白可以通过避免动态生物相关信息的丢失来提高活体成像的时间分辨率，特别是在连续长期生物成像的情况下。因此，需要验证其稳定性。在应用新制造的Cu-In-Se@MSN之前纳米复合材料作为活体成像的探针，与分散在50%乙醇/50%胎牛血清混合物中的Cu-In-Se量子点的发光强度相比，在功率密度为0.14W cm2的808 nm激光照射2h后，Cu-In-Se@MSN-2在高盐的PbS和FBS溶液中的光漂白作用可以忽略不计。此外，Cu-In-Se@MSN-2在37°C的热PBS和FBS中的荧光强度在800min内表现出优异的稳定性，而未经二氧化硅包覆的Cu-In-Se量子点的光学性质在3h后明显恶化。将Cu-In-Se@MSN固体粉末存放在冰箱中，在不需要进一步保护的情况下，可以稳定几个月。上述数据揭示了Cu-In-Se@MSN在不同环境中的长期光稳定性。在荧光性质方面，我们以Cu-In-Se@MSN为例，说明了Cu-In-Se量子点的组装越致密、越稳定，其发光强度越强，发光寿命越长。

图5：注射不同Cu-In-Se@MSN探针对正常裸鼠血管成像的比较。A)尾静脉注射成像探针示意图B)脉注射Cu-In-Se@MSN-2探针C)静脉注射Cu-In-Se@MSN-1探针的NIR-II显像D)注射Cu-In-Se@MSN-2探针24小时后的裸鼠高倍率NIR-II血管成像(E)在(D)高倍率血管图像中沿着白虚线的代表性的PL横截面强度分布。高斯拟合配置文件以红线显示。

最后，在上述Cu-In-Se@MSN探针体外NIR-II成像的鼓舞下，进一步验证了它们在活体成像中的应用。将寿命较长的Cu-In-Se@MSn-2探针和寿命较短的Cu-In-Se@MSn-1作为对照探针分别静脉注射到正常裸鼠(n=3)体内，注射剂量为20 mg kg−1(图5a)。然后在选定的时间点收集连续的全身NIR-II图像。如图5b所示，在注射Cuin-Se@MSN-2探针后2小时，可以识别腹部区域的血管结构，并且随着时间的推移背景保持干净，可以明显地看到腹部的血管结构。相反，当使用Cu-In-Se@MSN-1作为对照探针时(图5c)，整个身体(如肝脏、心脏、肾脏和肠道)都有明显的背景噪声干扰，几乎看不到血管结构。随后进行了高倍率的NIR-II成像，以可视化血管结构(图5d)。显然，腹部区域可见具有高阶分支的小血管(如图5d的插图所示)，表明Cu-In-Se@MSN-2探针用于血管成像的空间分辨率很高。相应的血管横截面强度曲线以尖锐的峰值为特征(图5e)。通过计算截面强度分布的高斯拟合半高宽(FWHM)进一步测量血管直径。所选腹部血管的半高宽值分别为≈123和101µm。因此，用Cu-In-Se@MSN-2作为活体成像探针可以更准确、实时地确定血管的较小分支和高阶分支。

参考文献

Chang,B., Zhu, H., Wu, Y., Wu, S., Zhang, L., Qu, C., Ren, Y., Cheng, Z.,Aggregation-Induced Phosphorescent Imaging in the Second Near-Infrared Window.Adv. Optical Mater. 2021, 2101382.

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