抗体药物中的寡聚体和添加剂的分析

      人血清多克隆IgG的分析结果如下图所示。使用流动相溶解IgG，以10mg/mL浓度进样5μl。除了单体外还检测出了二聚体和更大的寡聚体。如果关注单体和二聚体的分离，就会发现LW-803的效果比本公司原有产品KW-803及其他公司产品优异。

      其次，是来自重组CHO细胞的单克隆IgG的分析结果，如下图。进样量为20μl，浓度为1mg/mL。果然出单体外，还检测出了二聚体、三聚体以及寡聚体。在单体和二聚体的分离、二聚体和三聚体的分离方面，LW-803的性能均优于其他产品。

       下图为BSA的分析结果。2mg/mL浓度进样5μL。除单体外也检测出了二聚体和三聚体。

       将谱图错开，使BSA的峰处于同一位置，得到下图。

理论塔板数（TPN）和单体、二聚体的分离度（RS(M/D））如下表所示。从结果看出，LW-803的分离性能最好。

      下图是浓度为10mg/mL的多克隆IgG，进样量从1-100μL注入LW-803时的色谱图，以及样品进样量和理论塔板数以及单体和二聚体分离度的关系。

      进样量在1-20μL范围内，分离性能保持不变。即使进样100μL（绝对注入量1mg），分离性能也不会有太大的下降（分离度在1.5以上），可以满足高载样量要求。

      ODP2 HP-2D的填料基质为聚羟基甲基丙烯酸酯。由于亲水性高，和一般的ODS色谱柱不同，对于蛋白质等样品由于疏水性相互作用很难保留。在碱性条件下可以完全抑制疏水性相互作用。另外，由于孔径为40Å，也能起到尺寸排阻的作用，蛋白质也可能在V0处被洗脱。这样，IgG和反相模式下保留的表面活性剂可以充分分离。为了不将IgG导入MS，在UV检测器后面配置了切换阀，将色谱柱中0-5min流出的液体导入废液瓶，5min以后的液体导入MS机器。

      此处分析的表面活性剂，选择了抗体医药制剂中经常使用的Tween（polysolvate）。Tween如下图所示，由山梨醇骨架、聚乙二醇单链和酯键连接的长链脂肪酸构成。

      Tween并不是单一的结构，而是包含了各种结构的成分。所以首先通过扫描测定选择了强检出成分，用那个离子通过SIM做检量线，尝试定量。样品为Tween 50mg/L，IgG 1g/L，NaCl 0.3mol/L的混合水溶液，进样量皆为2μL。

      流动相中使用氨水得到Tween20的SIM谱图。监测离子是m/z735.7。比较不含有IgG和NaCl的情况（图a）和包含IgG和NaCl的情况（图b），可以发现两者的色谱图非常一致，离子抑制作用对于定量几乎没有影响。检量线（图c）也有良好的直线性。

      使用Tween20一样的方法分析Tween80。监测离子为m/z848.8。比较不含有IgG和NaCl的情况（图a）和包含IgG和NaCl的情况（图b），可以发现两者的色谱图非常一致，离子抑制作用对于定量几乎没有影响。检量线（图c）也有良好的直线性。

      Shodex PROTEIN LW-803在IgG和其寡聚体的分离上表现优异。在更低分子量领域分离性能也高，是在抗体分解物和其它蛋白质分析领域非常实用的色谱柱。此外，也能对应高载样量样品。

      Shodex ODP2 HP-2D可以在IgG和NaCl存在条件下分析非离子性表面活性剂Tween，而并不需要进行除蛋白和脱盐的前处理。在碱性条件下，IgG可以完全在V0处被洗脱，这里充分利用了聚合物基质色谱柱强耐碱性的优点。高效的Tween高灵敏度分离方法，也可以在抗体与药制剂领域中应用。通过使用50mm长度的色谱柱ODP2 HP-2B，可以得到更高速的分析。