如何找回消失的碳信号——珊瑚来源真菌次级代谢产物聚酮化合物核磁结构解析过程

近期，中科院南海海洋研究所从南沙群岛海域的珊瑚中分离得到一株海洋真菌，命名为SCSIO SX7W11。经ITS序列分析鉴定为Parengyodontium album。在其大米培养基和PDB液体培养基的次级代谢产物中分离出一种聚酮类化合物。我们以该化合物为例介绍如何应用ACD/Labs Structure Elucidator Suite (简称SES)软件快速解析出该化合物的正确结构。

图1，该聚酮化合物结构

由高分辨质谱（MS-，m/z=299.0200）可以得知该化合物的分子式为C15H8O7，1D NMR 13C谱图上可以看到13个峰，且均集中在低场区，基本均为sp2杂化碳原子。同时在分析数据时需要注意碳谱峰的个数与分子式中显示碳的个数差别，说明该碳谱图中有碳的信号缺失或者重叠。

图2，该聚酮化合物碳谱图

再来分析该化合物的1H NMR谱图，谱图的所有谱峰集中在低场区，且有一氢的化学位移为12.19ppm，该氢很有可能为-OH活泼氢，多为羧基氢。局部放大芳环区域谱图，发现存在一组（d，t，d）峰，由此可以大致判定结构中存在苯环的3个连续相邻的氢。

图3，左侧为化合物的1H NMR谱图，右侧为芳环区局部放大图

在解析数据时可以考虑检索数据库，ACD/Labs SES内建40万结构核磁实验信息数据库，以及10000万结构预测数据库。可以使用碳谱同时检索数据库，下图是软件在检索数据库时的设定参数。可以设定过滤掉整体化学位移平均偏差大于2ppm的结构（Reject structures  with Match Factor more than 2ppm），允许检索到的结构的碳的数目比碳谱实际峰的个数多3个（Allow lack of signals in ''full'' structure 3 signals)。允许单个碳的最大偏差10ppm（Minimum/Maximum possible tolerance for all atoms no more than 10ppm）

图4，碳谱图检索内部数据库和PubChem数据库参数

检查检索结果，发现有一个命中结构与实验碳谱非常接近，结构中也包含苯环3个相邻的sp2杂化-CH片段，符合1H NMR谱的特征。其结构碳谱与实验碳谱比较图如下:

图5，检索命中结构的碳谱与实验碳谱比较图，上图为命中结构碳谱， 下图为实验碳谱

对比两者谱图发现，命中结构中存在一52ppm左右的碳信号，其对应结构片段为连O的甲基，在实验的碳谱中没有发现该信号，所以目标结构很有可能是羧酸甲酯脱甲基变成羧酸。其余位置谱图特征基本相似，但是在135ppm附近命中结构有两个碳信号，而在实验谱图的位置只有一个碳信号，结合分子式与实验谱图碳信号的差异，有理由怀疑此位置实验谱图存在一定的问题。接下来有必要仔细检查此区域的相关信号，包括碳谱和其余所有的2DNMR实验谱图信号。

图6，HMBC谱图在135ppm区域放大图。左图为不正确的信号处理方式，右图为正确的信号处理结果

仔细检查HMBC信号发现在135ppm左右区域，2D相关信号与1D碳的信号存在一定的位置偏差（如左图所示），如果再添加一个碳的信号（如右图所示），2D信号与1D碳信号的吻合度会更好。所以有理由缺少的两个碳其中一个在此位置（135.71ppm），另外检查碳谱的积分值发现，136.32ppm处碳的积分值明显偏大，积分值大于1，这很有可能是两个碳重叠到一起了。至此，我们已经顺利找到了丢失的两个碳的可能位置。

接下来的工作是将修正后的结构对所有的NMR谱图进行归属验证，无论从化学位移还是相关信号上看修正后的结构均为最佳结构。

图7，在NMR Workbook Suite中将所有谱图对结构进行归属验证，结构上颜色色块表示碳谱归属质量检查，绿色色块表示实验碳谱化学位移与预测化学位移偏差小于3ppm，黄色表示偏差在3-10ppm之间，结构上只存在很少（两处）黄色色块，表明结构与谱图的吻合度较高

此案例解析的难点在于谱图上的碳信号与高分辨质谱提示的分子式不同，如何找到正确的位置对谱图的解析工作至关重要。在解析未知结构尤其是天然产物结构时，检索数据的意义重大，可以从数据库的检索结果中获得相关线索。

此案例数据来源于中科院南海海洋研究所宋永相老师，在此感谢宋老师对ACD软件的的大力支持。

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