细胞培养液组分分析新思路（附专题网络讲座）

生物治疗药物工艺开发过程中，细胞培养基溶液为细胞正常生长和生物治疗药物生产提供必要组分和营养成分。培养基溶液是包含数百种化合物的复杂混合物，其中包括起始化学物质以及在生产周期中形成的代谢物。培养基的组成在细胞生长周期中不断变化。已有研究表明，监测培养基成分及代谢物并确保这些物质保持在合理范围内，对于细胞生长、生物治疗药物滴度和产品质量都有影响。常规监测关键培养基成分，已成为生物工艺流程的⼀部分。生物制造行业的生物工艺开发和优化领域对全面监测培养基中存在的所有成分及代谢物有越来越高的需求。

为保障细胞稳定快速生长，必须对细胞培养基的质量、批次重现性严格控制。监测培养基成分及其代谢产物可为细胞生长、产品质量提供有效信息人，然而培养液组分中化合物种类多，且理化性质不一，传统的分析方法需要将其分成多个方法分析测试，耗时耗力。沃特世科学家团队开发出最新方法包，利用高分辨率质谱BioAccord LC-MS系统进行细胞培养基组分分析，包含：全面的反相LC-MS方法、200多种化合物数据库；简单的数据审查、分步工作流程（包括趋势图）；一套未知物筛选工具；多变量数据分析工具和报告模板。该方法已成功用于克隆筛选和工艺优化的细胞培养基分析。

为帮助大家了解更多关于细胞培养液组分分析的相关知识，沃特世将开展一场“细胞培养液组分分析网络讲座”，感兴趣的朋友请扫描下方二维码报名。

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 讲座时间：2021年11月25日（周四） 14:00 - 15:00

 讲座概要：

• 沃特世细胞培养基、培养液组分分析解决方案 — 三重四极杆液相质谱

• 基于BioAccord  LC-MS系统的细胞培养液组分分析方案介绍

 演讲嘉宾：

夏方莹— 沃特世资深应用工程师

毕业于中国科学院上海生命科学研究院，从事质谱领域近8年，拥有扎实的色谱质谱知识及使用经验。

邵锴 — 沃特世生物制药高级市场专员

负责生物制药市场开拓及相关应用支持工作， 主要负责BioAccord等高分辨质谱产品在生物制药领域相关分析与支持工作，涉及工艺开发、质量研究等方面。

图1. BioAccord/waters_connect用于细胞培养基组分分析。

整个流程采用搭载ACQUITY Premier的BioAccord LC-MS系统及ACQUITY Premier HSS T3色谱柱，不同类别化合物均可获得窄而对称的色谱峰，针对同分异构体化合物如亮氨酸/异亮氨酸、柠檬酸/异柠檬酸，也能达到优异的基线分离。

图2. 提取离子流色谱图(XIC)叠加图；同分异构体化合物的分离结果。

系统性能测试结果显示，6次重复进样保留时间 (漂移<0.02 min)，质量数误差(<5 ppm)，峰响应(<5%)具有优异的重现性。此外，系统能够提供优越灵敏度，检测限范围低至亚ng/mL到ng/mL级，BioAccord系统以其良好的灵敏度和重复性能够全面支持细胞培养基组分监测分析。

表1. 典型化合物6次重复进样的重现性结果

图3. 科学数据库中化合物类别（左），数据库中化合物显示示例（右）。

创建一个包含200多种化合物的UNIFI数据库，以便在分析中鉴定和跟踪这些化合物。每个化合物的保留时间和碎片离子数据使用确证化合物标准品推导并确认。每种化合物在数据库中按照几大亚类进行标记：氨基酸、氨基酸衍生物、有机酸、维生素、核酸/碱基和核苷酸等。还包含每种化合物的首选电离模式(ESI+或ESI-)。标记信息可用于在数据库搜索、将化合物导入分析方法或在建立工作流程时创建筛选器的过程中检索化合物亚类。

生物工艺开发项目通常会产生许多需要分析的细胞培养基样品。在每个样品中，生物工艺工程师想要获取信息以供审查的化合物种类可能会超过100种。因此，必须拥有⼀个精简的数据审查流程，轻松提取所需信息，以加快开发过程。UNIFI信息学系统中提供的工作流程旨在根据功能、类别和/或其他标准对处理后的数据进行直接审查和分步审查。创建涵盖样品运行列表、化合物类别和样品间比较等关键步骤，以展示如何在UNIFI中采集并显示信息。化合物审查可通过进样间趋势图、叠加图和/或列表信息来管理。还可自定义工作流程，轻松添加特定步骤以涵盖目标化合物、关键化合物对和/或特定的转化途径。还可自定义编辑工作流程，轻松添加特定步骤以满足数据审查需求，并且相关工作流程能够直接导出或导入，以便于其它waters_connect软件平台/数据处理工作站共享。

图4. 细胞培养基数据审查默认工作流程

图5. 细胞培养基DMEN在ESI+电离模式下得到的叠加色谱图。

图5为市售细胞培养基溶液DMEM的叠加色谱图，DMEM包含浓度范围为μg/mL级至100μg/mL级的氨基酸和维生素。将该培养基用水稀释100倍，进样2 μL。采用BioAccord LC-MS系统获得了优异的色谱性能，成功检出所有化合物。

在分析来自上游工艺开发中生物反应器的培养基溶液时，跟踪培养基中特定成分随培养时间和/或不同生物反应器的丰度变化很有用。在长达12天内以6个时间点采集来自12个生物反应器的样品组，并利用本方法进行行分析。下图显示了来自所有生物反应器和所有采样日期的胆碱丰度的总体趋势图。下面每个分组趋势图的柱形图分别代表⼀个生物反应器的时程。通过该视图可以清楚观察到工艺开发过程中细胞培养基成分的变化。

图6. 12个不同反应器多日内的趋势图。

图7. m/z 427.0950未知物的解析方法设置及ChemSpider数据库搜索结果。

细胞培养基营养成分代谢是一个复杂的过程，在生物治疗药物生产过程中形成但未能通过数据库匹配鉴定的代谢物仍然值得关注，尤其是当它们关系到产品滴度、产品质量属性或工艺参数时。以m/z 427.0950丰度最高的未知化合物为例，通过ChemSpider数据库进行搜库，匹配为半胱氨酸-谷胱氨肽，并用其标准品进行验证，发现此未知化合物在不同生物反应器中不同培养天数下，变化明显。此外，推荐使用“碎裂模式下的全扫描”进行采集，以同时采集母离子和碎片离子数据，通过这种方式采集的碎片离子数据有助于鉴定并减少数据库搜索中的假阳性结果。

UNIFI信息学系统中可提供另一种基于Umetrics EZ-info软件的多变量数据分析工具。EZ-Info可提供大批量数据批次间比较，例如，用于相同/不同细胞系的多个生物反应器的数据集比较、用于同一生物反应器中不同培养时间的培养基成分的数据集比较，或用于不同生物反应器相同培养时间点的数据集比较，以及用于其它比较的数据集。图8显示了对12个生物反应器进行多天数采集的样品进行多变量数据分析示例。根据质量范围、保留时间和响应进行相关化合物选择，选择的化合物可自动转移至EZ-info进行分析。PCA图提供了不同生物反应器及不同取样时间点之间差异性的总体视图，S-Plot可生成相应一对数据进行对比查看，这里选择起始培养天数和培养16天数据。这种数据处理方法可使用户快速确定与样品差异性相关的成分。

图8. 多变量数据分析的示例输出(左)PCA 图，按不同生物反应器的采样日期着色，（右）第0天和第16天细胞培养基的S-Plot（第16天下调的标志物用红色突出显示）。

提供缺省报告模板，便于汇总和展⽰细胞培养基分析结果，这大大缩短了与合作者或样品提供方交流分析结果所需的时间。报告由以表格格式(xls)导出的数据和以PDF/XPS格式导出的文本/图形组成。文本/图形报告包含的信息包括文件名、LC-MS方法详细信息、样品运行列表、以单个化合物或多种化合物叠加显示的柱形图或折线图等。还可以添加公司徽标图片。可通过用户友好的报告模板工具自定义或编辑报告，并可通过修改现有报告或添加额外的报告对象来生成新的报告模板。

BioAccord LC-MS系统具有易于设置、性能稳定和操作简便的优势，该平台使LC-MS经验有限的生物工艺开发工程师能够快速、轻松地运行和处理大量细胞培养基样品，并提供有关培养基添加剂以及在生物工艺发过程中所形成代谢物的丰富、深入的信息。

该方法包基于反相分离原理开发，可涵盖细胞培养基中存在的⼤多数成分。ACQUITY Premier液相色谱系统和色谱柱所采用的MaxPeak HPS技术可为各种化合物类别提供更⾼的色谱性能。此外，将Premier技术和化合物数据库纳入分析方法中，得到了⼀种高性能平台和端到端工作流程，涵盖细胞培养液分析所需的关键步骤，有利于LC-MS技术在生物工艺开发领域的应用。

该方法已成功用于分析起始培养基溶液以及来自上游工艺开发和优化中生物反应器的培养液样品。

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