助力发现增强CAR-T疗效新途径,流式中的战斗机!

2021-11-10 19:05:27, 陈老湿 德国赛多利斯集团


前言


大家好,陈老师又出现了,但是这次介绍的不是老本行Octet®分子互作系统,而是一款流式细胞仪中的战斗机——iQue®!这种高通量流式检测速度有多快呢?20分钟就能分析完一块384孔板,5分钟分析完一块96孔板,而且配备了相应的高通量分析软件Forecyt®!今天陈老师就来唠一下一篇用这款iQue®高通量筛选的能增强CAR-T杀伤小分子的文章。

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CAR-T细胞疗法,患者自身的T细胞(一种免疫细胞)从血液中提取出,随后对它们进行基因改造,使得它们表达嵌合抗原受体(CAR),这种受体使得它们识别并摧毁癌细胞。在对其他形式的治疗产生抵抗力的某些血癌和淋巴瘤中,CAR-T细胞疗法取得了出色的结果。但是仍有10-20%接受CAR-T治疗的患者没有反应或者仅有轻微的反应。今天介绍的案例中,来自赫尔辛基大学的学者发现了能增强CAR-T作用的小分子,并发现了新的肿瘤细胞杀伤机制,并发表在血液病学的顶级杂志《BLOOD》上[1]

这篇文章主要技术路线为:

  1. 加入效应T细胞和小分子库筛选观察小分子对一种表达荧光素的初级B细胞系杀伤的增强或者抑制作用(荧光素酶法),并检测这些小分子对TCR相关信号通路激活相关因子表达的影响(流式细胞法)。

  2. 同路线1,将一种肿瘤细胞替换成不同的表达荧光素的初级B细胞系,检测筛选出的小分子对不同细胞系的CART杀伤活性抑制或者增强。

  3. 检测筛选出的小分子对白血病病人中的初级B细胞系的CAR-T杀伤的增强作用(流式细胞法)。

  4. 用CRISPR基因编辑研究影响癌细胞对CAR-T细胞的敏感性的机制。

其中iQue®高通量流式细胞仪是这篇文章的主要技术手段之一,在路线的1和3中都用到了哦!因为这次涉及526个小分子(每个小分子5个浓度)的筛选,至少要7块384孔板(或者28块96孔板),所以iQue®就大显身手了!

小分子库的TCR通路激活筛选

为了检测TCR激活信号通路相关蛋白NFAT, NF-kB和AP-1的表达,使用能报告三种蛋白编导细胞系Jurkat,即如果TCR通路激活,细胞内的GFP荧光上升。

将小分子库以不同浓度和Jurkat细胞和T细胞混合后,孵育24小时,使用iQue® Screener流式细胞仪检测,划出细胞群后,根据NFAT, NF-kB, AP-1的荧光强度进行筛选,计算右上门(NFAT/NF-kB)和右下门的平均荧光强度,并以只加DMSO的阴性孔作为normalize。

MAPK信号通路抑制剂 refametinib和trametinib以及针对 SRC/LCK酪氨酸激酶 (ponatinib, dasatinib, saracatinib)对CART有抑制作用,并抑制TCR信号通路激活相关因子表达。

但是通过荧光素酶实验筛选出的能增强CAR-T杀伤的SMAC(second mitochondrial-derived activator of caspase,caspase激活剂,可以促进细胞凋亡)类分子并不能激活TCR信号,说明这类分子是通过其他的机制来增强CAR-T的杀伤作用。

小分子增强CART对肿瘤细胞杀伤作用

Birinapant是荧光素酶实验中筛选出的增强CAR-T杀伤的小分子药物,属于SMAC类分子。将多份急性白血病(ALL)的骨髓单核细胞提取物与T细胞以及Birinapant混合,然后用iQue®式观察CAR-T对B细胞的杀伤效果。

对Annexin V阴性和7-AAD阴性分门,然后统计CD19阳性的细胞数。在1:4效应细胞和靶细胞实验中,加入Birinapant可以增强CAR-T的杀伤作用。

随后这些研究人员用CRISPR-Cas9基因编辑方法发现启动死亡受体信号转导(death receptor signaling)过程所需的FADD基因对于CAR-T细胞功能至关重要,并揭示了SMAC类分子的作用机制是启动了死亡受体信号转导。

《iQue®3为新一代CAR-T开发
提供更智能的解决方案》

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赛多里斯生物分析产品主打高通量的概念,除了一天可以测试上千样品的结合动力学的Octet®分子互作分析系统,还有细胞水平或者分子水平结合的iQue®高通量流式细胞仪,以及可以连续数天甚至数周自动拍摄上万张高清晰图片的Incucyte®实时活细胞成像系统。陈老师要改名陈老筛啦,因为这些适合高通量筛选的仪器都是陈老师的宝贝啦!

另外还有一点,这三款仪器颜值都很高哦!


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iQue® 高通量流式细胞仪

Incucyte® 实时活细胞分析系统

Octet® 分子互作分析系统




-参考文献-

Olli Dufva et al. Integrated drug profiling and CRISPR screening identify essential pathways for CAR T cell cytotoxicity. doi:10.1182/blood.2019002121.


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