项目文章Nat Commun(IF 14.919) | 定量蛋白组学助力发现帕金森病治疗新靶点

已知多巴胺激动剂可诱导GSH的合成，即意味着多巴胺受体调控GSH的合成，而GSH主要在星形胶质细胞中产生，作者早期的研究也已证实星形胶质细胞多巴胺D2受体（DRD2）抑制了PD脑内的炎症反应，故推测星形胶质细胞多巴胺受体调控GSH合成，作者利用蛋白组学等一系列实验证实了该观点并探究了具体的分子机制。

1. 星形细胞DRD2通过Nrf2激活促进GSH合成

为验证多巴胺受体是在星形胶质细胞还是神经元中诱导GSH的合成，作者使用多巴胺激动剂（卡麦角林）（不同浓度梯度和时间梯度）分别处理两种细胞，结果表明，星形胶质细胞（非神经元）上的多巴胺受体的激活诱导了GSH的合成（图1a-1b）。通过DRD2受体激动剂（如喹吡罗）及DRD2敲除鼠（Drd2hGFAPcKO小鼠）证实多巴胺受体DRD2（非DRD1）促进了GSH的合成（图1c-1e）。流式、基因集富集分析、Nrf2敲除等实验证实了DRD2的下游效应蛋白为转录因子Nrf2（图1f-k）且DRD2的激活通过增强Nrf2与Gclc和Gclm基因启动子的结合从而增加Gclc和Gclm(GSH合成的两个关键酶)的表达(图1l-n)。

2. DRD2诱导了PKM2的二聚体化，从而结合并激活Nrf2的功能

转录因子与基因启动子的结合需要转录共激活因子的协助，作者采用Labelfree非标记定量蛋白组学的方法筛选到PKM2（M2型丙酮酸激酶）为Nrf2的转录共激活因子（图2a-2b），进一步实验证实DRD2的激活诱导了PKM2-Nrf2的相互作用（图2c），且PKM2是以二聚体（非四聚体）的形式与Nrf2结合从而激活了Nrf2与Gclc、Gclm的结合进而促进GSH的合成（图2d-2h)。

3. DRD2的激活促进了β-arrestin2与PKM2的结合并促进PKM2的二聚化

DRD2的激活会影响G蛋白信号通路和β-arrestin偏向性信号通路，为验证DRD2激活诱导PKM二聚化的具体分子机制，作者利用Gαi蛋白抑制剂（图3a）、β-arrestin2敲除（图3b-3i）实验证明DRD2的激活是通过β-arrestin2与PKM2结合从而促进了PKM2二聚化。

4. 吡哆醇通过PKM2-Nrf2途径促进GSH的合成

GSH的减少为PD的主要诱因之一，为找到一种能促进GSH合成的小分子化合物，作者对863种天然产物进行了筛选，根据这些化合物的Tm值的偏差、是否可以二聚化PMK2、是否可以在星形胶质细胞中提高GSH水平以及对细胞的毒性这几种因素，最终找到了化合物：吡哆醇（即维生素B6）(图4a-4e)。并进一步实验证明了其可以二聚化PMK2、可以增强Nrf2与Gclc/Gclm的结合能力、可以促进GSH合成（图4f-4l），且PKM2敲除后，上述功能失效。

5. 吡哆醇以不依赖DRD2的方式减少PD小鼠模型中的多巴胺能神经元损失

实验结果显示吡哆醇可以在DRD2敲除鼠中二聚化PKM2以及增加Gclc/Gclm的表达、促进GSH的合同，而DRD2激动剂（喹吡罗）在DRD2敲除鼠中无法发挥其功能，故证实吡哆醇是通过DRD2非依赖的形式通过PKM2-Nrf2途径促进GSH的合成(图5a-5d)。作者随即在DRD2敲除鼠中先注射吡哆醇或DRD2激动剂（喹吡罗）后加入MPTP(构建小鼠PD模型的试剂)的方法检测多巴胺神经元的受损情况，进一步证实了吡哆醇发挥作用是不依赖于DRD2的且在MPTP前给予吡哆醇可以减轻多巴胺能神经元损失的严重程度（图5e-5h）。