利用logD图辅助进行液相方法开发的案例

作为药物分析研究员来说，我在液相方法开发时的工作压力最大。因为在开发前不知道自己可以用多久完成它，它不像验证检测，我可以推算出自己的完成时间从而合理安排工作。有时候千辛万苦的开发出了方法，结果在验证、转移、稳定性检测时出现问题，方法需要再开发。甚至还涉及到方法前后数据的对比，及评估前期数据是否真实反映了工艺的结果，困难重重。

之前的HPLC方法通常是使用试错法或一次一个因子(OFAT)进行方法开发的。根据分析人员的知识和经验确定关键方法参数，小步微调去改变一个个色谱参数，直到达到色谱峰之间的足够分离度。影响分离的参数有7-8个，每个都依次考虑，这会显著增加实验次数。在检查对分离的影响低的不太相关的参数时，往往无效又耗时。此外，也很少在研究中考虑参数之间的相互作用。

我们需要改变方法开发的方式！

一年前听了肖柏明老师的课，有种豁然开朗和找到方向的感觉，前期对于方法开发，往往不知道怎么做是对的，只能一个一个的试，或根据自己的以往经验或直觉尝试。通过听肖老师讲课，学到了根据分子结构和理论知识指导开发，从logD图进行分析指导方法开发策略。学到了从哪里思考，怎么思考。再将这些知识应用于实际工作中，结果发现，方法开发开始变得简单了，我可能不需要再像以前那样加班加点用时间去堆方法来获取成功，可以高效的完成工作。以下是自己的部分使用案例，希望可以对阅读者产生思考和帮助。

(1). 研究的MFB的项目，发现各国药典流动相中均添加了离子对试剂庚烷磺酸钠，见下图。

但根据MFB结构进行分析，其应该有一定的疏水性，可能不需要离子对试剂，对其结构及考察杂质做logD图，发现各pH条件下组分的logD图均大于0，即普通的C18柱即可保留。

考虑到工艺优化中需要MFB的中控方法检测，如果采用药典的离子对试剂方法，则方法平衡时间和冲柱时间会比较久，离子对试剂也会对色谱柱造成不可逆损伤，故在中控方法开发时，去掉了离子对试剂，采用pH7.0磷酸盐缓冲液和乙腈做流动相，发现开发出来的方法中各组分均有保留和分离。

MFB供试品+杂质混合溶液色谱图

(2). MNT项目：MNT各国药典均有收载，方法流动相中均添加了离子对试剂庚烷磺酸钠，通过预测MNT及其杂质的logD图，对结构进行分析，发现其有一定的疏水性，故在中控方法开发中去掉离子对试剂进行开发，最终方法下各组分均有一定的保留，且专属性符合要求。

KPA及其起始物料、中间体logD图见下；

LogD图解析：（1）pH2-8范围内，logD均大于1，有疏水性，普通的C18即可保留；（2）大部分组分没有酸碱基团，pH变化，logD不变，呈一直线，故对于无酸碱基团的组分方法开发，流动相选择时可以无缓冲，直接选择水；（3）各logD线基本分离，无重合，故组分分离难度应该不大；（4）pH大于8时，三个组分的logD会随pH变大而降低，该范围内，方法的重现性可能较差，故兼顾各组分，为保证方法的耐受性，流动相pH选择2-8范围内。（5）从该logD图看，各中间体的中控方法均可以在同一流动相体系下调整梯度程序进行开发。

据上，根据logD提供的信息，我们设计了方法开发策略，并让实验员根据策略进行开发，在2个起始物料、5个中间体，1个成品的8个方法开发过程中，实验人员基本没有遇到方法开发的问题，问题存在时根据已有信息进行指导，很快解决并完成了方法开发，在整个开发过程，我们没有盲目试错，根据理论知识指导开发，优化措施更有针对性，结果也经常如我们预料，极大地提高了工作效率。

NDE药典收载方法中，流动相选择酸性流动相中添加离子对试剂；TFA布参考标准流动相采用pH6.8磷酸盐缓冲液和乙腈。根据logD做图，发现各组分logD线均在pH6-8范围内基本不变，且logD值大于1，有一定疏水性，故选择普通C18柱在流动相pH6.8处调整梯度程序，采用单一方法检测NDE和TFA及其杂质。

logD代表在不同pH的条件下，化合物在正辛醇和水溶液中的分配系数比值的对数值。LogD能够真实反应目标化合物在不同pH条件下的疏水性。

疏水性是化合物在色谱柱上分离的重要影响因素。我们可以根据logD图判断是否仅用疏水性即可达到保留和分离目的，还是根据施耐德疏水减法模型“logɑ=log(k/kEB)=Ƞ´H-δ´S+β´A+ɑ´B+κ´C+π´P+μ´D”。需要引入其他作用力进行保留或分离。

对于酸碱性物质，根据logD图我们应该如何选择方法中的流动相pH。在方法开发过程中，我们可以根据方法参数、logD图及检测图谱进而分析方法的保留机制，从而判断影响方法的关键参数，指导方法开发。

logD图可以很好的将化合物的结构与保留联系起来，指导和帮助我们根据化合物结构进行方法开发，提高方法开发能力，缩短方法开发时间。

点评

ACD/Labs 阎作伟

液相分析方法开发从来就不是一个简单的事情，这是一个严谨的科学活动。基于AQbD的理念进行分析方法开发将能够保证方法的专属性高，耐用性好。知识空间的准备是实施AQbD理念的第一步，ACD/Labs把自己的核心能力pKa和logD的预测的能力组合在一起，形成了AutoChrom里的pHSelector组件。显然长沙晶易的姚倩已经应用的非常精熟。从案例上来看，她用这个工具来读懂目标物的特性，读懂原来方法的特性和缺点，找到了更好的设计空间方向，加以实践，以实际行动证实了科学计算的有效性。