数字PCR技术的昨天今天与明天

数字PCR技术也称为第三代PCR技术，是一种核酸高灵敏检测和绝对定量的新方法。同传统的PCR相比，数字PCR增加了对反应体系进行分隔（Partition）的操作，将几十微升的反应体系分隔成了数万微小独立反应体系，核酸模板在这种分隔过程中被充分稀释，理想状态下每个微滴中含有1个分子的核酸模板，扩增完成后对所有的液滴进行荧光信号识别并计数，计算出阴性和阳性反应的数量，通过泊松分布原理计算靶标分子的浓度。从而实现靶标分子的绝对定量。数字PCR不依赖标准曲线定量，并且不受PCR扩增效率影响，具有更高灵敏度和准确度。

数字PCR的原理示意图

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Bert Vogelstein 等人在美国科学院院刊PNAS上首次提出了数字PCR (Digital PCR, dPCR) 的概念，并表明该技术可用于研究罕见的癌症突变。            

Bert Vogelstein

Kinzler 和Vogelstein 继续完善dPCR，并创建了一种改进的方法，他们将其称为BEAMing技术，即“珠子，乳状液，扩增和磁性”的首字母缩写。BEAMing技术使用乳状液在单个试管中分隔扩增反应。这一变化能在一次运行中将该PCR扩展到成千上万的反应。  

随着纳米制造技术和微流体技术（nanofabrication and microfluidics）的发展，数字PCR技术遇到了突破瓶颈的最佳契机。

Fluidigm公司推出了第一台商业化的基于芯片的商品化数字PCR系统，Fluidigm的IFC平台使用物理矩阵的策略，他们的qdPCR 37K系统“集成电路”利用该公司的微流控专长，可将48个样品逐个分布在770个微反应单元中。

Life technologies推出了QuantStudio3D数字PCR系统。采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20000个单独的反应孔中。在整个工作流程中，样本之间保持完全隔离，可以有效防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计避免了微滴式系统可面临的管路堵塞问题。

dPCR的基本方法都已经建立，根据反应单元的不同形式，主要可分为 微板式 、 微腔式 和 微滴式 三大类系统。

现在市场上主要的数字PCR产品主要是基于 微滴式 和 芯片式 ，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系统和Thermo Fisher公司的Quant Studio系统等。

数字PCR分类及特点

随着数字PCR技术的不断发展，领航基因通过不断研发创新，于2020年6月推出全自动液滴数字PCR系统AD16之后，再次打造出 独家7色荧光通道数字PCR ，这是当前全球多色荧光数字PCR技术的最高水平。

基于七色荧光通道生物芯片阅读仪（CS7），可以极大地满足多重基因靶标检测，尤其适用于生命科学研究及精准医疗的快速诊断。

大幅超越国际常规的2～3色荧光通道，荧光通道无串扰、信号采集快、信噪比高。不仅有力地拓展了基因多重检测的应用空间，满足临床上对多项指标联合检测需求，还可以节约珍贵样本、检测时间和试剂成本。

支持单次高达96张液滴芯片的全自动扫描分析，单张芯片从扫描检测到数据分析不到1分钟，简化操作流程的同时提升了检测效率。

仅需1次加样操作，在一张芯片上实现均一稳定的液滴生成、单分子PCR扩增及大面积铺展检测，样本封闭在芯片内部，杜绝交叉污染

基于自主开发的人工智能算法能够精准定位液滴，自动判读阴阳性点，区分不同拷贝数之间的微小差异，满足客户各类配套开发需求。

数字PCR是生命科学领域最引人瞩目的创新之一

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dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应， 在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。

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在大量野生型基因存在的情况下精准地检测低含量的突变基因是目前的研究难点之一，竞争性反应严重影响突变基因的检测。dPCR技术从背景序列中检测低丰度目的序列的能力和高灵敏度的特点使得这一技术特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

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数字PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。

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FAM、HEX和Cy5通道浓度平均值和CV值的数据表明， 在所述的实验条件下，三种测试浓度之间没有统计学差 异(p<0.05)。

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血液、粪便、食品、土壤等样本中含有大量PCR反应的抑制物，极大地影响 了PCR反应效率。另外，在某些检测中，难以制备测定标准曲线所需的标准物质。dPCR不受PCR抑制物的影响、不依赖标准曲线的优势，使其特别适合于这些复杂样本中基因表达的准确定量检测。

数字PCR与qPCR核酸检测技术对比

科学界对于数据准确性和结果可靠性的要求越来越高，更多的实验室将目光转向拥有绝对定量方式、高灵敏度和高重复性特质的数字PCR技术。dPCR作为一种新兴的靶核酸绝对定量技术，对低丰度DNA具有高度的敏感性和特异性，对扩增抑制剂具有高度的抗性。因此，dPCR可用于低拷贝病毒的检测、病毒载量的测定、标准物质的制备、环境中病毒浓度的监测、病毒变异的检测和SARS-CoV-2药物的评价。                                      

数字PCR产业链的中上游主要为仪器、耗材的研发，具有明显的封闭式特点，产业链的下游根据不同渠道分别对应不同的应用场景。全球基因行业巨头例如 Illumina、Roche、ThermoFisher、Bio-Rad、Qiagen 等均已布局数字 PCR 技术领域，极大地推动了该领域的产业化进程。从2011年国外最早商业化的数字PCR至今经过10年的发展，其技术原理和检测方式得到了广泛的认可。

领航基因致力于数字 PCR 产业链上中游产品的研发、生产和销售，覆盖数字 PCR 技术相关的设备、芯片和体外诊断试剂等产品，为用户提供最佳的整体解决方案。从2014年成立至今，持续高效地推出了系列产品注册上市。从2018年国内第一台独立自主知识产权的三色荧光通道芯片数字PCR系统（C2400）获批上市，到2019年推出全新五色荧光通道液滴数字PCR系统（D3200），2020年持续推出推动全自动数字PCR体系构建系统（AP10）和全自动液滴数字PCR系统（AD16）上市。领航基因不断完善数字PCR产品线，根据客户不同的应用需求提供灵活的硬件配置和完善的配套服务，推动数字 PCR平台的明天走向星辰大海。