直播回顾 | 生命科学扫描电镜制样培训班

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倪教授从取材、固定、脱水、临界点干燥整个制样实验流程做了详细的介绍。因为扫描电镜需要观察表面形貌，取材上要格外注意样品表面的清洗，除去附着在样品表面的杂质覆盖物。针对不同的样品，主要采取流洗、换洗、漂洗、酶解、离心和有机溶剂清洗等方法。样品清洁后，将样品依次进行戊二醛和锇酸的固定，并洗净固定液；固定好的样品用乙醇进行梯度脱水，当样品脱水至100%乙醇后，即可进行临界点干燥、真空镀膜，进行扫描电镜观察。

对于样品固定和脱水的过程，为提高制样效率，避免实验人员过多接触有毒化学试剂，倪教授建议采取Leica EM TP组织处理机来完成。Leica EM TP一次可以处理56个样品，适用于透射、扫描电镜制样，对于用于光镜分析的较大组织块，还可以配备LM模块，满足光学显微镜制样要求。

样品处于100%乙醇中后，下一步就是除去乙醇将样品进行彻底干燥。干燥方法主要包括真空干燥法、临界点干燥法、冷冻干燥法（叔丁醇）、莰烯干燥法、HMDS（六甲基二硅烷）干燥法等。临界点干燥法由于干燥过程中利用超流体状态的二氧化碳作为媒介，避免了样品气液交界面表面张力对样品表面的破坏，优越地保持了样品的自然生理状态，是现在样品干燥的主流选择。

Leica EM CPD300是针对二氧化碳临界点干燥方法专门设计的的临界点干燥仪，适用于脱水于无水乙醇和无水丙酮的样品。样品舱室有175ml大容量，对于不同的样品还有多种样品支架和样品篮可供实验者选择。多种规格填充板设计，也大大节约了乙醇与二氧化碳使用量。倪兵老师详细介绍了Leica EM CPD300的使用经验，还针对细菌、花药等易松散的小样品分享了自己的DIY的小工具和装样品的技巧。

样品在彻底干燥后，需要进行最后的镀金处理，使样品表面导电，防止样品在扫描电镜下的产生荷电效应。倪教授介绍了离子溅射镀膜的原理和应用。

Leica EM ACE200/600是集蒸镀、离子溅射镀膜、辉光放电等功能于一体的多功能真空镀膜仪。Leica EM ACE600还可以配备双侧靶头、电子束蒸发镀膜和冷冻断裂、冷冻镀膜等附件，还可以与冷冻真空传输系统（Leica EM VCT500）及套件联用，将常规扫描电镜升级为冷冻扫描电镜。

最后，倪教授介绍了华东师范大学闵行校区电镜中心及配备的设备，非常欢迎大家访问交流。

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徕卡真空冷冻传输系统包括EM VCT500（真空传输）和EM VCM（真空冷冻传输工作站），可以连接多款冷冻制样设备和电镜设备，是冷冻扫描电镜制样路线中的重要节点和传输工具。

冷冻传输系统在冷冻扫描电镜技术中的应用非常广泛，如材料科学样品（乳浊液、聚合物、界面多层结构、纳米结构、液态结晶体），工业样品（化妆品、食品、药物），生物样品（类膜结构、细菌、细胞器、蛋白）等。

冷冻扫描电镜制样技术路线一般包括：高压冷冻（EM ICE）或投入冷冻仪（EM GP2）→真空冷冻工作站（EM VCM）→真空冷冻传输（EM VCT500）→冷冻断裂/蚀刻/镀膜（EM ACE600/900）→真空冷冻传输（EM VCT500）→冷冻扫描电子显微镜。对于想观察光滑界面的样品，在冷冻镀膜前还可以使用冷冻离子束切割（EM TIC 3X）配合低温冷台在低温下加工出平整的界面。冷冻离子束切割（Leica EM TIC3X）有三把氩离子枪从不同的角度同时轰击样品，从而实现对样品高效的、原子水平的加工。配备多种类型样品台，适用于EM ICE 样品托和各类工业材料样品。可联合EM VCT 500进行常温真空和冷冻真空加工、传输，功能强大，适用于多种如易氧化、热敏感的样品。

最后，徕卡冷冻真空传输系统还可以配合徕卡冷冻光电联用技术路线，实现冷冻光电联用→冷冻离子束减薄（FIB）→冷冻透射电镜观察，最后通过冷冻断层成像实现囊泡、小组织三维重构和大分子的原位结构解析。

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最后由徕卡材料电镜制样专员包沈源博士给大家介绍了徕卡高真空镀膜仪（EM ACE600）的详细操作。包博士介绍了EM ACE600的结构组成、膜厚检测的原理及原件的更换、不同靶材的使用特点和更换方法，内容非常详尽。

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