利用微孔板读板机检测 Gαq 介导的信号通路——均相时间分辨荧光（HTRF）技术

HTRF^® 是均相时间分辨荧光技术的简称，是 Cisbio 公司开发的用于检测生物分子相互作用的实验技术⁴。HTRF^® 技术将荧光共振能量转移（FRET）技术与时间分辨（TR）荧光技术相结合，可以消除荧光寿命较短的背景荧光，提供更高的灵敏度和稳定性。该检测方法使用铕（Eu³⁺）或铽（Lumi4^™-Tb）的穴状化合物作为供体，荧光团（XL665 或小分子 d2）作为受体。当供体和受体距离足够近时，供体被一个能量源激发，可以引发能量转移到受体，使其在特定波长发出荧光。

在这里，我们展示了如何使用 SpectraMax^®i3x 和 SpectraMax^®iD5 多功能微孔板读板机应用 HTRF 技术进行 Gαq- 偶联受体的分析。G 蛋白偶联受体的分析主要通过检测 cAMP 和 IP3 这两条信号转导通路调控介导的细胞内钙离子水平的升高。Cisbio 公司的 IP-One Gαq 试剂盒通过检测 IP3 的稳定下游代谢产物一磷酸肌醇（IP1），为钙离子检测提供了一种替代方法（图 1），实现对 Gαq 介导的信号通路的检测。

GPCR 的 Gαq 激活后会诱导产生磷脂酶 C（PLC），PLC 的代谢产物为 IP1。在氯化锂（LiCl）存在的情况下，IP1 的降解被抑制并在信号细胞中积累（图 1）。在 IP-One HTRF 实验中，带有 d2 受体的 IP1 可以与细胞产生的天然 IP1 竞争，结合带有穴状化合物供体的 IP1 特异性单克隆抗体。细胞产生的未标记 IP1（天然 IP1）的增加会导致 TR-FRET 的中断和 HTRF 信号强度的减弱（图 2）⁵。IP-One 检测可用于表征贴壁细胞或悬浮细胞中作用于 Gαq- 偶联受体的化合物。通过 HTRF 的方法，使游离 IP1 与被标记的 IP1 与抗体竞争性结合，从而阻断 FRET 过程，达到检测样品中 IP1 分子浓度的目的，并实现对 GPCRs 的筛选。

图 1 Gαq 通路的激活。IP1 是第二信使 IP3 的下游代谢产物，在 LiCl 存在时积累。

图 2 HTRF IP-One 竞争性结合试验的原理。d2 受体标记的 IP1 与天然（未标记）IP1 竞争，以结合供体标记的 IP1 特异性单克隆抗体。未标记 IP1 的增加会导致 TR-FRET 的中断和 HTRF 信号的减少。

如产品使用说明书 ⁶ 所示，IP1 标准品制备的最终浓度范围为 1.9 nM至 7700 nM。包括一个没有任何未标记 IP1（最大 FRET）的阳性对照和一个没有 IP1 或抗 IP1-d2 抗体的阴性对照。如图 3 所示，试剂的最终用量为每孔 20 µL。将微孔板在室温下孵育 1 小时，使用 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机读取数据。调整延迟时间，间隔时间和脉冲次数以优化设置，直到 △F％ 显著增加（请参见下面的数据分析）。优化设置如表 1 所示，并且可以将表 1 中列出的优化设置应用到同一型号的任何酶标仪上。

图 3 384 孔微孔板的测定设置。IP-One Gαq 试剂盒中包含“ StimB”（刺激缓冲液）。

表 1 SpectraMax i3x 和 iD5 微孔板读板机的仪器设置。这些设置针对 IP-One Gαq 的检测进行了优化，可能与其他 HTRF 检测使用的设置略有不同。

HTRF 分析使用 Cisbio 公司的专利比值测定法，该方法基于检测到的两个发射波长。将供体在 616 nm 处的发射作为内参，受体在 665 nm 处的发射作为被测生物反应的指示。这种比值测定方法可以减少孔间误差并消除复合干扰。在下面第 4 步中计算的 △F 反映了分析背景的信号，适用于批间分析的比较。根据 665 nm/616 nm 比值计算得到的结果用 △F 表示如下:

使用 SoftMax^®Pro 软件生成和分析数据，该软件包含预先配置的 HTRF 协议，可以简化使用上述方法进行检测和分析的流程。