定量PCR扫盲贴（一）

       对于刚刚接触荧光定量PCR仪的朋友，对相关概念的理解和结果的判断，时常感到一头雾水，接下来我们用通俗易懂的语言，为大家做定量PCR仪扫盲贴，助力您顺利完成实验。

       对于荧光定量PCR，有几个基础的概念我们必须要熟记于心。

荧光定量PCR实验原理

       在普通PCR中，只在扩增结束后通过超微量或者电泳的方式来检测扩增产物的浓度。而在荧光定量PCR中，由于添加了特殊的染料，随着扩增过程中不断的解链、延伸，荧光染料不断的结合到目的片段中，相应的荧光信号也在不断增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（比如40个循环），就可以得到下面的扩增曲线图（横坐标代表扩增的循环数cycle，纵坐标代表荧光的强度）。

阈值线

       一般来说，在前15个循环中，积累的荧光信号比较弱，将其作为本次实验的荧光本底信号。通常来讲，阈值就是3-15个循环荧光信号标准差的10倍。那为什么要设置阈值线呢？我们知道PCR仪在扩增过程中产物的累积是符合S型增长曲线的，前期产物较少信号较弱，后期达到平台期时产物大量扩增后无法严格遵循指数扩增，只有在中间某段区间才是严格的指数扩增。因此如果想要定量分析，获取模板的初始浓度，直接根据最终浓度进行计算显然是不准确的。

       随后科学家们换个思路，划定一个荧光信号值，各个样品在指数扩增时会先后达到这个信号值。这个时候就可以根据到达该信号值的先后顺序，来判断各个样本初始模板浓度的高低。举个例子：百米赛跑的终点线是一样，假设各个选手跑步速度也一样，那么最先跑过终点的，他最开始离终点线也越近（请欣赏小编的灵魂画风）。

       而这个信号值，就称之为“阈值线”。说的这么严肃，其实很多仪器自动设定的阈值线基本能够满足我们的实验要求，不需要我们手动设置的。

CT值

      CT值和阈值线是密切相关，当产物信号累计到阈值线的时候，此刻已经历的循环数，即称之为CT值。同一个实验中，如果变动阈值线，其CT值也会随之变动。，

标准曲线

       做标准曲线有什么用呢？使用一些已知浓度的样品进行扩增，各个浓度梯度均有对应的CT值和荧光信号强度，模板浓度越高，CT值越小。只需要将待测品的CT值或信号强度代入公式，即可准确求出它的浓度。那怎么做标准曲线呢？标准品按照一定的倍数稀释5-6个浓度左右，软件会自动生成标准曲线，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线，如下图。而未知样品的拷贝数即可根据曲线方程计算得来。我们可以通过购买或自行制备质粒来获取标准品。

熔解曲线

       简单点说，就是考察染料标记法结果的特异性。再简单点，就是快速确定引物是否有效。

       复杂的原理就不解释了，关键是怎么看和怎么判断。如果反应产物条带单一，曲线会出现一个尖峰；如果有引物二聚体或者非特异性的扩增，就会出现至少两个峰或更乱的峰形。采用SYBR Green染料时强烈建议勾选熔解曲线。

       了解了这些，是不是觉得荧光定量PCR仪不过如此嘛。其实在做的过程中，一不小心就会遇到很多“坑”——即异常曲线。下面列举几个比较常见的问题：

     （1）扩增曲线经过40个循环后没有平台期？或者扩增曲线根本无法呈现指数上升？

       这种情况下很有可能是你的起始模板浓度太低了，即便经过40个循环也是达不到平台期的，可以通过增加循环数来验证是否是该问题。

     （2）熔解曲线的问题：比如多个峰，或者尖峰的前面有个小小的小峰，或者没有峰？

       这个跟引物以及反应的体系温度有关系，如果说没有峰值或者杂乱无章，很有可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时候有小的峰，可以通过优化反应条件，比如退火温度的优化来消除这个影响。

       这几种情况是最为常见的，做定量PCR其实很容易，但想做的完美就有些难度了。下一期我们再来聊聊不常见的异常曲线，以及影响定量结果的因素。

        敬请期待哦！