新方法！空间代谢组低丰度特征代谢物的信息发掘

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中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室再帕尔•阿不力孜团队在Analytica Chimica Acta期刊发表的题为“A graphical data processing pipeline for mass spectrometry imaging based spatially resolved metabolomics on tumor heterogeneity”的研究成果，作者建立了一种基于质谱成像的空间代谢组学数据处理流程，发现它在肿瘤异质性表征和微区低丰度生物标志物发掘方面重要作用，并以甲状腺乳头状癌为例，评估了该数据处理流程在空间分辨代谢组学分析中的可靠性。

个体内部癌细胞会经历代谢重编程和异质性，与代谢异质性相关的空间信息和时间变化通常反映了肿瘤的进展、转移和预后。基于质谱成像（MSI）的空间分辨代谢组学是一种强大的分析工具，可探索肿瘤代谢物的化学空间关系。MSI能保留大量在现场同时解吸和电离分子的空间信息，也可以保留组织活检的整体形态，是一种探索肿瘤代谢和微环境中相互作用的方便且有前途的技术。

由于生物组织中内源性代谢物的复杂性和组织异质性，空间分辨代谢组学的应用仍然具有挑战性。在本研究中开发了用于肿瘤微区异质性的空间分辨代谢组学分析的数据处理流程，包括基本统计算法、数据预处理、组织学驱动和特征化的离子图像覆盖以及基于代谢特征的空间分割。该图形数据处理流程已内置到带有MSI软件的图形界面中。应用该数据处理流程对12例甲状腺乳头状癌进行空间分辨代谢组学分析，这些病例具有明显的组织异质性。该流程更加有效且便于使用，可更好地发现肿瘤异质性差异并发掘低丰度特异性代谢物的微区信息。

1.样本收集

甲状腺肿瘤组织在液氮中速冻，在80℃储存。MSI分析之前，在-20℃下将组织切成8毫米的厚度，并在显微镜载玻片上解冻，并于在真空干燥器中直接干燥约1-2 h。其中一些连续的组织切片用于H＆E染色分析。

2.质谱成像分析

气流辅助解吸电喷雾电离（AFADESI）结合Q-Orbitrap质量分析仪，全扫描模式，质量分辨率为70000，m / z <1000 Da的代谢产物。

3.数据分析

集成的数据处理管道内置到图形软件MassImager中，包含七种数据预处理方法。使用Makerview软件将每个ROI的平均质谱图导出并重新排列为2D矩阵，使用SIMCA完成了对12例甲状腺乳头状癌（PTC）的统计评估。使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）的数据映射方法在MATLAB中进行空间分割分析。

1.肿瘤异质性和全代谢谱

仅一次MSI采集，就能在原位生物组织中微米范围内同时检测数千个分子。大型MSI数据集进行深入的生物信息研究会产生不可避免的背景噪声和数据变化，这些都会影响潜在生物标记物的发现。如图1B所示，生物组织区域产生了许多背景信号，强度大约为7个数量级（E7）。作者使用背景减法，消除了来自高丰度背景离子的干扰（图1C），在生物组织的质谱图中检测到更多的中等丰度（E6附近的强度）内源性代谢产物。然而低丰度的重要代谢物（E5）仍被掩盖（图1D），它们在直接筛选分析中很容易被忽略。

图1 | 通过质谱成像获得的甲状腺肿瘤的质谱特征

作者也对肿瘤组织进行了异质性鉴定。使用正电离模式AFADESI-MSI分析了1例甲状腺肿瘤。图2所示为六种代表性内源性代谢物的提取离子图。每种离子在组织切片中均表现出独特的分布，主要表现出范围和强度上的差异。接下来，基于层混合进行多个离子通道叠加并结合组织病理学评估，在H＆E染色图像中观察到了几种细胞类型，包括肿瘤细胞，基质细胞和正常细胞（图2D）。上述离子在微区中的分布是重叠或互补的，在代谢水平上揭示了肿瘤组织异质性。图2A中的离子图像反映了基质细胞的分布，图2B和2C中的离子图像证明了肿瘤区域和正常区域之间的区别。

使用t分布随机邻居嵌入（t-SNE）的无监督方法对包含空间分辨信息的整个组织数据集进行评估，以自动生成空间分割（图2E）。光谱密切相关的像素被识别为一个簇并以相同颜色显示。结果表明大多数簇与H＆E染色图像中定义的解剖特征相对应。例如红色簇表示肿瘤细胞，而灰色表示基质细胞。在癌旁区域还发现了许多新的空间分割。结果表明，一些代谢异质性隐藏在形态相似的区域下。因此，肿瘤组织中同时存在组织学和分子肿瘤异质性，通过典型离子的可视化和自动空间分割可以清楚地识别出这些异质性。

图2 | 甲状腺肿瘤组织切片中六种代表性内源性代谢物的分布

2.图像叠加和数据提取

使用MassImager构造和实现一种用于匹配光学图像的精细方法，以准确地指导感兴趣区域（ROI）的选择并实现指定微区域精确数据的提取。作者提出了一种图形组织学驱动和图像叠加的ROI选择方法。首先，选择要表征整个组织轮廓的离子，导入几种光学图像（例如H＆E和免疫染色图像），通过图形界面实现与MS图像的最佳对齐。

其次，选择具有特定分布的典型离子进行显示，通过调整光学图像的透明度，最终识别出具有共同覆盖的形态结构和离子图像的目标区域，如图3所示。对于普通单元，有两种数据提取方法。ROI可以通过病理划分（H＆E染色图像）或分子分割（t-SNE可视化）进行确认。后者可以进一步识别正常细胞的子区域，并从所需的子区域中准确提取隐藏的代谢谱（蓝色，图3D）。连续的组织切片常用于H＆E染色和MSI检测。该方法将组织学与分子表达相关联，使其特别适合于连续切片的分析。

图3 | 甲状腺肿瘤组织中微区的划分，包括肿瘤细胞区、基质细胞区和正常细胞区

3.数据预处理

预定义ROI中的每个像素都可以视为2D数据集中的样本。分子质荷比（称为特征）在多元统计分析之前需经适当数据预处理，因此本文的数据处理流程中提供了七种数据预处理方法，包括线性转换（居中对齐、归一化、自动缩放、UV缩放和帕累托缩放）和非线性转换（对数转换和平方根转换）两种形式。每种方法都有优点和缺点，要根据组织样本和原始数据集的特征以及分析的目的选择最佳方法。

对于一个甲状腺肿瘤样品，首先通过组织学驱动和图像叠加的ROI选择完成了从肿瘤组织（I组），相邻正常组织（II组）和背景区域（III组）的原位数据提取。为了考察聚类效果和筛选生物标记物，本文选择四种预处理方法与未预处理的数据集进行比较（图4）。经最小二乘判别分析（PLS-DA）最终得分图和分类图显示，在数据预处理后三组之间可更好的聚类。不仅群内相交减少，群内聚类也更加集中。由于背景峰的减少以及技术和测量误差的减少，可以在预处理的MSI数据集中发现更多的低丰度生物标志物。与非线性转换相比，三个线性转换给出了几乎相同的多元统计结果；而对数转换可揭示更多的低丰度生物标志物，并产生更好的分类结果，表明此统计数据集可能是异方差的，采用对数转换以使数据集同方差将是有利的。通过上述方式，甲状腺肿瘤组织和正常组织之间的生物学相关差异可显著增强。

图4 | 在PLS-DA分析之前，将图像叠加层与不同数据预处理方法进行比较的建议途径

4.在肿瘤微环境代谢组学分析中的应用

接下来以12例甲状腺乳头状癌（PTC）为例进行研究，以评估该数据处理流程在空间分辨代谢组学分析中的可靠性。导入组织切片的H＆E染色图像，并与相应的MS图像对齐（图5A）。叠加分析后，精确定位肿瘤、基质和正常组织的区域（距肿瘤区域1mm和3mm）。在使用OPLS-DA进行统计比较之前，对四组提取的代谢物特征进行Pareto缩放处理。最后通过OPLS模型的评分图可以清楚地区分肿瘤、基质和正常组织的。正常组织样本（包括距肿瘤区域1mm和3mm的组织样本）紧密地归为一类，这表明与肿瘤或基质区域的组织相比，这些组织的代谢谱非常相似（图5B）。另外从以前的研究中选择了四种代表性的代谢物来研究它们在PTC的不同微区中的表达。统计分析表明，苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸在肿瘤中表达最高，并显示从肿瘤到基质和正常组织的逐渐减少的趋势。相比之下，肌酐在肿瘤中的表达最低，而在基质和正常组织中则表现出明显的上调（图5C）。

图5 | 基于离子图像和光学图像的耦合匹配叠加，对从不同甲状腺肿瘤微区提取的代谢组数据进行统计分析

本文建立的数据处理流程已构建一种易于操作的图形工具，集成图像叠加、数据提取和数据预处理，用来处理复杂的空间代谢组学数据。遇到具有明显异质性的生物组织时，通过将代表性的离子图像与组织学或基于代谢特征的空间分割相叠的ROI选择方法可以实现精确的定位，然后从指定的组织微区中准确提取出代表性的代谢谱。在多元统计分析前可多种数据预处理方式，这些数据预处理方式揭示了丰度低但具有重要生物学意义的代谢物差异。

基于色谱的代谢组学研究大多数都集中在肿瘤与相邻正常组织之间的生物标记上，而忽略其在基质组织中的表达。本研究验证了肿瘤与邻近正常组织之间苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和肌酐的差异表达。该研究还揭示了肿瘤与基质区域之间的差异表达。作为肿瘤微环境的重要组成部分，间质组织与相邻正常组织的代谢特征相似，但仍有细微差异。因此本文建立的数据处理流程可获取每个感兴趣微区域的精确代谢信息，还有助于在多变量统计分析过程中准确解释不同微区之间的代谢差异，以进行肿瘤异质性研究。使用这种图像叠加和最佳数据预处理方法流程，有助于发现更深层的基础生物学信息，将在空间分辨代谢组学（尤其是异质肿瘤代谢研究）的生物标志物发现中发挥重要作用。

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嫣然 撰文

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