CEM Liberty Blue在长难肽固相合成上的突破

2021-05-27 17:39:52 培安有限公司

自从上世纪六十年代，美国生物化学家R.B.Merrifield发明了多肽的固相合成法^[1]而获得诺贝尔化学奖以来，多肽化学作为生物化学的前沿一直被科学家们视为研究的热点，多肽类药物也正如雨后春笋般陆续上市。

近年来，全球多肽药物市场快速发展，多肽药物也成为新药研发的重要方向。如辉瑞、默克、罗氏、礼来、诺华、赛诺菲、拜耳等大型跨国制药企业，均通过收购或并购形式加大了对多肽药物研发的投入，并相继收获了不少上市药物。全球有代表性的多肽药物有利拉鲁肽、杜拉鲁肽、格拉替雷、亮丙瑞林、奥曲肽、戈舍瑞林和艾塞那肽等。

查询Cortellis数据库^[2]，截至2019年5月7日，全球多肽合成药物相关数量为1153种。2018年上市的多肽药物为198种，其中，长链肽占68.3%。多肽药适应症广泛，包括肿瘤、心血管疾病、内分泌代谢类疾病等重大疾病或较普遍的疾病都有涉及，其中针对肿瘤的药物数量最多。其它如骨质疏松、抑郁症、抗过敏性休克、止痛、治疗便秘和激素调节方面也都有相关的项目出现。

20世纪80年代，几乎所有处在临床试验阶段的多肽长度都少于10个氨基酸^[3]。此后10年中，长链多肽逐渐增加。多肽药物研发以越来越转向长链肽的筛选和应用。目前上市的多肽中，绝大部分都是40个氨基酸左右的长肽。

然而长难肽的合成将面临以下几个问题：1）反应时间长；2）反应不完全副产物多；3）分离纯化困难^[4、5]。1992年，中国台湾大学的于明辉等^[6]采用微波辅助进行了固相多肽合成，发现微波辅助固相多肽合成可以极大的提高固相多肽合成的产率，甚至氨基酸间缩合效率可以达到100%。

CEM在微波固相多肽合成上的突破

世界微波化学创始者-CEM公司在2002年采用了新式的，反应温度，压力均可在线控制的单模微波反应器，研究了大立体位阻的Fmoc-氨基酸的连接。研究发现氨基酸缩合在1.5 min - 20 min之内均可完成，且不产生氨基酸消旋^[7]。

Liberty系列多肽合成仪改写了以往多肽合成时间以小时为计算单位的历史，创造性的使用分钟作为多肽合成时间的计算单位。完成一条多肽的合成时间甚至可以比传统方法完成一个氨基酸循环的时间还短。以其卓越的氨基酸耦合效率，极高的产率及产物纯度荣获2004年R&D100大奖。更被美国布鲁克黑文国立实验室选定为研究SARS研究的新工具^[8]。

Liberty Blue突破了氨基酸缩合效率的瓶颈

微波在多肽固相合成中具有以下特点[9]：1）提高反应速率缩短反应时间；2）提高反应转化率；3）不引起反应物改变。以困难肽ACP65-74为例详细对比了传统方法与微波合成氨基酸的缩合效率。

Liberty Blue突破了人工合成多肽长度的记录

1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利·普鲁辛纳Stanley B.P Prusiner，因为他于1982年发现发现了一种新型的生物——朊病毒Prion^[11]。然而其致病机理一直困扰科学家。墨尔本大学Karas J.A.使用Liberty Blue使用Liberty Blue合成了具有生物活性的朊病毒蛋白，创造了单次合成111个氨基酸多肽的世界纪录同时为朊病毒致病机理的研究做出了卓越的贡献^[12]。

CEM 利用电磁波能量促进多肽合成反应是一个重大突破。直接在分子水平上进行极性离子的耦合。分子运动试图与电场引起的运动同步，正是这种转移的动能，使处于微波场的多肽链不断调整，加快反应，有助于保持它的聚集，显著提高了合成结果。Liberty BLUE 完成传统方法不可能实现的困难合成。快速完成更多更长的氨基酸耦合，防止长链多肽聚合，消除双重耦合和差向异构化现象，同时降低树脂的要求。

Liberty 突破了传统长难肽合成纯度低的阻碍

HE-SPPS 是固相多肽合成的一个重要进展。在2003 年美国多肽研讨会上，CEM 介绍了一种利用微波能量来辅助合成多肽的新工艺，该工艺利用微波能量来实现多肽的去保护和耦合^[14]。该技术通过 CEM 的多肽合成仪对数千种多肽进行了改进。为了支持微波辅助固相多肽合成^[15]，CEM还使用了插入式光纤来监测真正的内部溶液温度。内部温度控制对于快速反应加热是必不可少的，因为众所周知，反应容器的外部温度可能与内部温度相差很大^[16]。

Liberty系列多肽合成仪受到了全世界多肽科学家的青睐。

“以高中生的实验水平都可以轻松使用Liberty Blue完成最复杂的多肽合成”

-刘磊教授，清华大学

“Liberty BLUE成就了多肽化学界最重要的变革，创多肽合成的多项世界纪录，从未看到如此高纯度、高难度的多肽合成，极快的合成，一天完成一个月的工作，大量合成有用的多肽，使我们的科研大大的加速。”

-Andreas Rybka, PhD Research Scientist AplaGen GmbH

“Liberty Blue快速，可靠，可生产高纯度的难肽，我们对Liberty Blue非常满意，并强烈推荐它用于蛋白质合成和方法开发。”

-Prof. Fernando Albericio， Group Leader Chemistry & Molecular Pharmacology Institute for Research in Biomedicine (IRB) University of Barcelona

“Liberty Blue系统毫无疑问是目前最好的肽合成仪，是PeptiDream公司的主要合成设备（12台Liberty 系统）。任何想要化学合成肽的公司，特别是那些含有非标准氨基酸的公司，Liberty都被高度推荐。”

-Dr. Patrick C. Reid President and Director PeptiDream Inc.

“Liberty Blue是市场上最好的多肽合成仪，它的合成速度和纯度是无与伦比的，使用Liberty Blue也使我们后续的纯化更容易，这是一个额外的惊喜。”

-Prof. Anna Maria Papini Coordinator of Interdepartmental Laboratory PeptLab

参考文献：

[1] Merrifield R B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide[J]. Journal of the American Chemical Society, 1963, 85(14): 2149-2154.

[2] https://clarivate.com/cortellis/

[3] 王志超, 安玉会. 生物活性肽的研究进展[J]. 河南医学研究, 2004, 13(4): 353-356.

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[8] 美国CEM公司. 世界微波技术先导[J]. 现代科学仪器，2003,4: 73-74

[9] 王卫国, 李佩华, 沈树宝, 等. 微波辅助固相合成胸腺五肽的研究[J]. 2006.

[10] 宓鹏程. 微波, 超声波技术在固相多肽合成中的应用[J]. 广东化工, 2018 (2018 年 03): 98-99.

[11] Hsiao K, Dlouhy S R, Farlow M R, et al. Mutant prion proteins in Gerstmann-Sträussler-Scheinker disease with neurofibrillary tangles[J]. Nature genetics, 1992, 1(1): 68.

[12] Karas J A, Boland M, Haigh C, et al. Microwave synthesis of prion protein fragments up to 111 amino acids in length generates biologically active peptides[J]. International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 2012, 18(1): 21-29.

[13] https://zhidao.baidu.com/daily/view?id=120126

[14] Collins J M, Collins M J. Novel method for enhanced solid phase peptide synthesis using microwave energy[C]//Biopolymers. 111 RIVER ST, HOBOKEN, NJ 07030 USA: JOHN WILEY & SONS INC, 2003, 71(3): 361-361.

[15] Sekhon B S. Microwave-assisted pharmaceutical synthesis: an overview[J]. Int. J. Pharm. Tech. Res, 2010, 2(1): 827-833.

[16] Herrero M A, Kremsner J M, Kappe C O. Nonthermal microwave effects revisited: on the importance of internal temperature monitoring and agitation in microwave chemistry[J]. The Journal of organic chemistry, 2008, 73(1): 36-47.