颠覆来袭 | 鹿明生物最新4D-PRM靶向蛋白质组学技术全新升级

2021-05-11 06:02:40, 多层组学定制服务 上海欧易生物医学科技有限公司


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前言

PRM为一种高分辨、高精度靶向质谱技术,可用于蛋白组学相关研究如大队列样本中候选生物标志物的验证(图1)。相较于传统SRM,PRM的优势是单针方法中增加靶向肽段数量、谱图具有高度专一性及共隔离背景肽段的高耐受度。过去PRM最主要的技术限制在于单针靶向离子数、色谱分离时间及整体检测灵敏度间具补偿关系,因此,若需要大量靶向肽段数量的完整数据,必须增加色谱分离时间或牺牲质谱的灵敏度与选择性。

图1 | PRM示意图


离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D-Proteomics™是在3D分离即保留时间(retention time)、质荷比(m/z)、离子强度(intensity)这三个维度的基础之上增加了第四个维度,离子淌度(mobility)的分离(图2),进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度,带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

图2 | 新一代4D-蛋白质组学示意图


近期,4D-蛋白质组学技术方案又得到了完美补充,即将捕集离子淌度技术和PASEF采集技术与PRM技术结合,打造了全新的高通量和高灵敏的靶向蛋白质组学技术——prm-PASEF,至此,prm技术也全面进入了4D时代。4D-PRM方法在传统蛋白组学中引入第四个维度——离子淌度,突破过去靶向组学的最大限制,在不牺牲检测灵敏度、扫描速度及选择性且单针靶向离子数最大化的前提下,展现高度重现性及准确定量,带领靶向蛋白组学突破研究瓶颈、进入新高度。prm-PASEF这种模式利用了TIMS进行第四维度分离,相对于普通的PRM提高了多肽离子的选择性和灵敏度,并结合了PASEF的高扫描速度从而增加了靶标离子的数量,实现更多、更快、更准确的靶向蛋白组检测,为靶向蛋白质组学在大队列中的应用带来无限可能。


鹿明生物4D-PRM技术优势

4D-PRM更高的验证通量

鹿明生物基于timsTOF Pro开发的4D-PRM在60分钟的色谱梯度实现100个差异蛋白的验证,相比较于3D-PRM验证通量在色谱梯度减少1/3的时间上蛋白数提高了2倍以上。这得益于timsTOF Pro大于120Hz的MS/MS扫描速度,prm-PASEF理论上每100ms的TIMS ramp time可靶向大于12个目标离子,在1s的duty cycle时间内则可靶向超过100个目标离子,使得prm-PASEF能够在短时间内定量到更多蛋白(图3)

图3 | prm-PASEF采集Cycle示意图


图4显示是我们在做PRM预扫得到的时间窗口图,在100个蛋白(300条肽段)做4D-PRM验证,10分钟窗口并行的肽段数50条,timsTOF Pro的扫描速度远远满足检测需求。

图4 | 扫描时间窗口设定


4D-PRM更高的离子选择性

4D-PRM的采集窗口包含色谱保留时间、离子淌度与四极杆隔离质荷比三个维度,在timsTOF Pro上,当存在保留时间及质荷比相同的母离子时,仍可以通过离子淌度这一维度进行分离,增加谱图专一性及定量准确性。图5所示即在未开启离子淌度时,谱图存在明显的杂峰,当开启时谱图排除了相关离子干扰增加了谱图的选择性也使定量更为准确。

图5 | 离子淌度过滤窗口可显著降低目标离子的背景


4D-PRM具有高度重现性及精准定量

PASEF快速的扫描能力能得到更多的数据采集点,产生专属性更高的MS/MS谱图,极大提高检测灵敏度和定量可靠性。鹿明内测数据中iRT标准肽段在所有样本中的保留时间非常稳定,说明定性准确(图6)

图6 | iRT内标肽段保留时间分布


示例肽段GTFIIDPGGVIR的峰图(不同颜色曲线代表肽段对应的二级碎片(b,y离子),同一肽段的所有b,y离子定量值的加和即认为是该肽段的定量值)和峰面积比较图均显示定量准确度极高,统计分析发现iRT肽段各重复之间变异系数均小于20%,说明4D-PRM重复测试之间定量稳定性良好,系统误差较小。

图6 |  GTFIIDPGGVIR峰图

图7 | GTFIIDPGGVIR峰面积

图8 | iRT肽段重复定量之间的变异系数


4D-DIA+4D-PRM联合分析

鹿明生物在纯4D-PRM的基础上,还实现了4D-DIA+4D-PRM的联合分析(图9),我们对于小鼠肝脏进行了4D-DIA的检测,从DIA结果中挑选出100个差异蛋白进行了4D-PRM的检测,PRM结果显示超过80个蛋白有较好验证,验证率达到80%以上。

图9 | 4D-PRM流程图


4D-PRM应用领域

由于不需要特定的抗体,因此PRM将来有望替代传统的western blot等验证方法。此外,依据timsTOF Pro捕集离子淌度技术高灵敏度及扫描速度的优势,发展出prm-PASEF方法,具有高灵敏度、扫描速度、选择性等优势,并在高靶向离子数与短色谱梯度的应用下展现高度重现性及精准定量,这进一步解决了传统PRM面临的挑战,必将促进PRM-PASEF靶向蛋白质组学技术在机体免疫机制研究、蛋白质翻译后修饰、临床诊断研究,生物标志物的验证和临床转化方面等的应用。

4D-PRM

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参考文献:

Bruker application note 1881734: prm-PASEF®: enabling high-throughput, high sensitivity targeted proteomics.

Antoine Lesur, et al., New prm-PASEF for highly multiplexed targeted acquisition inclinical samples,ASMS 2020 TP 470.

Florian Meier, et al., Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer, Molecular & Cellular Proteomics,2018, 17, 2534–2545.

Lesur A, Schmit P O, Bernardin F, et al. Highly Multiplexed Targeted Proteomics Acquisition on a TIMS-QTOF[J]. Analytical Chemistry, 2020, 93(3).



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END

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