项目文章 | iTRAQ定量蛋白质组学助力南京农大揭示紫花苜蓿抗镉分子机制

2021-03-27 22:27:11, 多层组学定制服务 上海欧易生物医学科技有限公司


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● 前言


欧易/鹿明生物客户南京农业大学沈文飚教授课题组在Journal of Proteomics发表的题为“Proteomic analysis provides insights into the molecular bases of hydrogen gas-induced cadmium resistance in Medicago sativa”的研究成果基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究,揭示了富氢水(HRW)诱导的镉(Cd)抗性主要分子靶点和代谢过程。



中文标题:蛋白质组学分析紫花苜蓿抗镉的分子机制

研究对象:苜蓿

发表期刊:Journal of Proteomics

影响因子:3.509

各作单位:南京农业大学

运用欧易/鹿明生物技术:iTRAQ定量蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)


● 研究背景


镉(Cd)是一种有毒金属,近百年来随着采矿和工业活动的增加,其污染日趋严重。众所周知,镉的积累改变了植物的代谢过程,如失活酶活性,产生活性氧,破坏营养物质的利用和光合作用,所有这些都导致了根系生长的抑制,黄化,甚至组织死亡[1]。因此,了解植物应对Cd毒害的机制是非常重要的。紫花苜蓿幼苗经HRW处理后表现出较强的抗镉性,其潜在的分子机制仍需进一步阐明。本研究基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究,揭示了HRW诱导的Cd抗性的主要分子靶点和代谢过程。


● 研究思路



● 研究结果


1.富氢水缓解镉对苜蓿幼苗生长的抑制作用,降低脂质过氧化,增加非蛋白质巯基(non-protein thiols,NPTs)、铁、锌含量

对苜蓿幼苗进行处理,分为镉单独处理组(Con→Cd)、富氢水处理后再进行Cd处理(HRW→Cd)、富氢水单独处理组(HRW→Con)、对照组(Con→Con);随后收集根组织样本进行生理生化指标检测。在镉胁迫下观察到苜蓿幼苗生长受到明显抑制(图1A)。地上鲜重下降24.3%,地下鲜重下降33.3%。与对照相比,单独HRW处理使苜蓿地上部分和地下部分幼苗鲜重分别提高了9.9%和16.7%(图1B)。为进一步评价镉的毒性,测定TBARS含量,以分析镉的脂质过氧化作用。Cd单独胁迫导致TBARS含量增加132.1%;但Cd胁迫前进行HRW预处理比Cd单独胁迫的样品下降了21.1%(图1C)。Cd胁迫使苜蓿幼苗根系NPTs含量较对照显著增加;HRW预处理后Cd胁迫的植株NPTs含量高于单独Cd胁迫的植株(图1D)。同时,在Cd胁迫下,HRW可诱导幼苗根系中Fe和Zn的含量增加,以缓解Cd诱导的离子缺乏(图1E)

图1 | HRW胁迫对苜蓿幼苗的理化指标


HRW胁迫对苜蓿幼苗生长(A)、鲜重(B)、TBARS(C)、NPT(D)和幼苗根系Fe、Zn含量(E)的影响


2.差异蛋白筛选及其功能富集分析

对苜蓿幼苗进行处理,分为镉单独处理组(Con→Cd)、富氢水处理后再进行Cd处理(HRW→Cd)、富氢水单独处理组(HRW→Con)、对照组(Con→Con);随后收集根组织样本进行iTRAQ定量蛋白质组学检测。共鉴定到了2377个蛋白,其中1254个蛋白含有至少2个特异性肽段。其中99个上调蛋白和32个下调蛋白与Cd处理相关。在HRW→Cd和HRW→Con 这2个比较组中,分别有126个和21个上调蛋白,55个和9个下调蛋白(图2)

图2 | 不同比较组的差异蛋白分布柱形图和维恩图


采用不同处理组的248个差异蛋白进行GO和KEGG功能富集分析(图3)。总的来说,167个蛋白有生物过程(BP)注释,其中212个条目显著富集;67个蛋白有细胞成分(CC)注释,其中41个条目显著富集;165个蛋白有分子功能(MF)注释,其中81个条目显著富集(图3A和3B)。在BP分析中,氧化还原过程最显著性富集,其次是一系列代谢过程,例如小分子代谢,有机酸代谢。CC分析表明,24%的注释蛋白质属于细胞质。KEGG分析表明,大多数代谢途径,包括碳水化合物、能量、脂肪和氨基酸代谢、次级代谢产物的生物合成,表现出了显著性富集(图3C)。结果表明,Cd胁迫下,植物螯合素等硫化合物对紫花苜蓿幼苗根系的HRW预处理有积极的响应。

图3 | 显著差异蛋白的GO和KEGG富集分析


根据GO、KEGG和蛋白表达水平筛选了92个显著差异蛋白,它们主要分为7个功能类别:防御和应激反应(10个蛋白)、硫化合物代谢过程(7个蛋白)、氨基酸蛋白质代谢过程(17个蛋白)、碳水化合物和能量代谢过程(18个蛋白)、次生代谢过程(6个蛋白)、氧化还原过程(32个蛋白)和金属离子稳态(2个蛋白)。如图4所示,使用OmicsBean软件可视化了蛋白与信号通路的相互关系,发现一些蛋白质可能参与了不止一个调控途径。例如,MTR_4g061130同时参与了硫化合物、有机氮化合物、有机酸代谢过程和防御反应。

图4 | 差异蛋白与信号通路的相互作用关系


3.差异蛋白的qPCR验证

IDH在蛋白组和验证实验中的表达趋势一致,说明蛋白数据具有一定的可信度(图5)。此外,通过比较Cd处理与HRW处理前后的数据,我们还发现了四种表达模式:

(1)Cd胁迫与HRW处理相比表达量几乎没有或略有变化;

(2)Cd胁迫下,HRW预处理后几乎没有或轻微改变;

(3) Cd处理有一个缓慢的增加,随后是一个更显著的增加;

(4)Cd胁迫下的初始下调,随后恢复。

图5 | qPCR验证结果


● 研究结论


富氢水(HRW)能有效缓解苜蓿幼苗Cd胁迫。在Cd和/或HRW处理的样品中,248个蛋白质的丰度有显著变化。其中92个与应激防御、氨基酸和蛋白质代谢、碳水化合物代谢、次生代谢过程有关,尤其与氧化还原过程、硫化合物代谢过程和金属离子稳态有关。这些发现与Cd胁迫下HRW预处理提高抗氧化能力、硫代谢激活、铁稳态重塑一致。这些工作可能有助于揭示HRW抗Cd药物的潜在机制。



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本研究基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究,揭示了HRW诱导的Cd抗性主要分子靶点和代谢过程。在经Cd和/或HRW处理后,鉴定出248个差异蛋白,筛选出92个蛋白质用于进一步的生物信息学分析。分析结果表明,这些差异蛋白的生物学功能主要分为七类:防御和应激反应、硫化合物代谢、氨基酸和蛋白质代谢、碳水化合物和能量代谢、次生代谢、氧化还原和金属离子稳态。此外,蛋白质表达模式与脂质过氧化降低、非蛋白硫醇丰度增加、铁和锌含量增加的结果一致,说明HRW主要通过减少氧化损伤、促进硫化合物代谢过程和维持营养元素平衡来减轻Cd的毒性。


文末看点

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参考文献:

Dai C., Cui W., Pan J., et al. Proteomic analysis provides insights into the molecular bases of hydrogen gas-induced cadmium resistance in Medicago sativa [J]. Journal of proteomics, 2016, 152:109-120.


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END

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