项目文章 | iTRAQ定量蛋白质组学助力南京农大揭示紫花苜蓿抗镉分子机制

欧易/鹿明生物客户南京农业大学沈文飚教授课题组在Journal of Proteomics发表的题为“Proteomic analysis provides insights into the molecular bases of hydrogen gas-induced cadmium resistance in Medicago sativa”的研究成果，基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究，揭示了富氢水(HRW)诱导的镉（Cd）抗性主要分子靶点和代谢过程。

镉（Cd）是一种有毒金属，近百年来随着采矿和工业活动的增加，其污染日趋严重。众所周知，镉的积累改变了植物的代谢过程，如失活酶活性，产生活性氧，破坏营养物质的利用和光合作用，所有这些都导致了根系生长的抑制，黄化，甚至组织死亡[1]。因此，了解植物应对Cd毒害的机制是非常重要的。紫花苜蓿幼苗经HRW处理后表现出较强的抗镉性，其潜在的分子机制仍需进一步阐明。本研究基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究，揭示了HRW诱导的Cd抗性的主要分子靶点和代谢过程。

1.富氢水缓解镉对苜蓿幼苗生长的抑制作用，降低脂质过氧化，增加非蛋白质巯基(non-protein thiols,NPTs)、铁、锌含量

对苜蓿幼苗进行处理，分为镉单独处理组（Con→Cd）、富氢水处理后再进行Cd处理（HRW→Cd）、富氢水单独处理组（HRW→Con）、对照组（Con→Con）；随后收集根组织样本进行生理生化指标检测。在镉胁迫下观察到苜蓿幼苗生长受到明显抑制（图1A）。地上鲜重下降24.3%，地下鲜重下降33.3%。与对照相比，单独HRW处理使苜蓿地上部分和地下部分幼苗鲜重分别提高了9.9%和16.7%（图1B）。为进一步评价镉的毒性，测定TBARS含量，以分析镉的脂质过氧化作用。Cd单独胁迫导致TBARS含量增加132.1%；但Cd胁迫前进行HRW预处理比Cd单独胁迫的样品下降了21.1%（图1C）。Cd胁迫使苜蓿幼苗根系NPTs含量较对照显著增加；HRW预处理后Cd胁迫的植株NPTs含量高于单独Cd胁迫的植株（图1D）。同时，在Cd胁迫下，HRW可诱导幼苗根系中Fe和Zn的含量增加，以缓解Cd诱导的离子缺乏（图1E）。

图1 | HRW胁迫对苜蓿幼苗的理化指标

2.差异蛋白筛选及其功能富集分析

对苜蓿幼苗进行处理，分为镉单独处理组（Con→Cd）、富氢水处理后再进行Cd处理（HRW→Cd）、富氢水单独处理组（HRW→Con）、对照组（Con→Con）；随后收集根组织样本进行iTRAQ定量蛋白质组学检测。共鉴定到了2377个蛋白，其中1254个蛋白含有至少2个特异性肽段。其中99个上调蛋白和32个下调蛋白与Cd处理相关。在HRW→Cd和HRW→Con 这2个比较组中，分别有126个和21个上调蛋白，55个和9个下调蛋白（图2）。

图2 | 不同比较组的差异蛋白分布柱形图和维恩图

采用不同处理组的248个差异蛋白进行GO和KEGG功能富集分析（图3）。总的来说，167个蛋白有生物过程（BP）注释，其中212个条目显著富集；67个蛋白有细胞成分（CC）注释，其中41个条目显著富集；165个蛋白有分子功能（MF）注释，其中81个条目显著富集（图3A和3B）。在BP分析中，氧化还原过程最显著性富集，其次是一系列代谢过程，例如小分子代谢，有机酸代谢。CC分析表明，24%的注释蛋白质属于细胞质。KEGG分析表明，大多数代谢途径，包括碳水化合物、能量、脂肪和氨基酸代谢、次级代谢产物的生物合成，表现出了显著性富集（图3C）。结果表明，Cd胁迫下，植物螯合素等硫化合物对紫花苜蓿幼苗根系的HRW预处理有积极的响应。

图3 | 显著差异蛋白的GO和KEGG富集分析

根据GO、KEGG和蛋白表达水平筛选了92个显著差异蛋白，它们主要分为7个功能类别：防御和应激反应（10个蛋白）、硫化合物代谢过程（7个蛋白）、氨基酸蛋白质代谢过程（17个蛋白）、碳水化合物和能量代谢过程（18个蛋白）、次生代谢过程（6个蛋白）、氧化还原过程（32个蛋白）和金属离子稳态（2个蛋白）。如图4所示，使用OmicsBean软件可视化了蛋白与信号通路的相互关系，发现一些蛋白质可能参与了不止一个调控途径。例如，MTR_4g061130同时参与了硫化合物、有机氮化合物、有机酸代谢过程和防御反应。

图4 | 差异蛋白与信号通路的相互作用关系

3.差异蛋白的qPCR验证

IDH在蛋白组和验证实验中的表达趋势一致，说明蛋白数据具有一定的可信度（图5）。此外，通过比较Cd处理与HRW处理前后的数据，我们还发现了四种表达模式：

（1）Cd胁迫与HRW处理相比表达量几乎没有或略有变化；

（2）Cd胁迫下，HRW预处理后几乎没有或轻微改变；

（3） Cd处理有一个缓慢的增加，随后是一个更显著的增加；

（4）Cd胁迫下的初始下调，随后恢复。

图5 | qPCR验证结果

富氢水（HRW）能有效缓解苜蓿幼苗Cd胁迫。在Cd和/或HRW处理的样品中，248个蛋白质的丰度有显著变化。其中92个与应激防御、氨基酸和蛋白质代谢、碳水化合物代谢、次生代谢过程有关，尤其与氧化还原过程、硫化合物代谢过程和金属离子稳态有关。这些发现与Cd胁迫下HRW预处理提高抗氧化能力、硫代谢激活、铁稳态重塑一致。这些工作可能有助于揭示HRW抗Cd药物的潜在机制。

本研究基于iTRAQ的定量蛋白质组学研究，揭示了HRW诱导的Cd抗性主要分子靶点和代谢过程。在经Cd和/或HRW处理后，鉴定出248个差异蛋白，筛选出92个蛋白质用于进一步的生物信息学分析。分析结果表明，这些差异蛋白的生物学功能主要分为七类：防御和应激反应、硫化合物代谢、氨基酸和蛋白质代谢、碳水化合物和能量代谢、次生代谢、氧化还原和金属离子稳态。此外，蛋白质表达模式与脂质过氧化降低、非蛋白硫醇丰度增加、铁和锌含量增加的结果一致，说明HRW主要通过减少氧化损伤、促进硫化合物代谢过程和维持营养元素平衡来减轻Cd的毒性。

参考文献：

Dai C., Cui W., Pan J., et al. Proteomic analysis provides insights into the molecular bases of hydrogen gas-induced cadmium resistance in Medicago sativa [J]. Journal of proteomics, 2016, 152:109-120.

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