Nat Biotechnol | （IF:36+）一篇运用了timsTOF Pro离子淌度的脂质组学自然科研期刊论文

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2020年10月日本理化学研究所综合医学科学中心Hiroshi Tsugawa和Makoto Arita教授课题组在Nature Biotechnology发表的题为“A lipidome atlas in MS-DIAL 4”的研究成果，开发了非靶向脂质组平台MS-DIAL 4，提供了脂质组学一站式解决方案，有助于标准化脂质组学数据并加速脂质组学研究。

脂质在生物学中起着重要作用，其可作为细胞膜的关键成分、信号分子以及能量存储分子和底物。它们的生物学功能主要由脂质结构的多样性驱动。理论上可以基于对每个脂质亚类中分子的结构相似性，通过对脂质亚类碎裂关系的解释来预测脂质的串联质谱谱图模式。尽管有各种脂质鉴定工具，但仍需要改进并系统的对脂质进行注释和定量。

图1 | MS-DIAL 4开发概述

1.开发 MS-DIAL 4 (Mass Spectrometry-Data Independent Analysis software version 4)

本文提供了一个非靶向的脂质组学平台，该平台在MS-DIAL 4（http://prime.psc.riken.jp/）中，并符合脂质组学标准计划（Lipidomics Standards Initiative, LSI）的半定量定义和脂质结构的简写表示法。它制定了117个脂质亚类中脂质的质谱碎裂模式以及离子淌度二级谱，以提供具有保留时间（RT），CCS (collision cross-section)和其他质谱信息的脂质组图谱。它代表了从导入原始质谱数据到导出通用输出格式（mztab-M）的一体化解决方案。

作者在十个独立的LC-MS平台上进行的81项研究中，处理了1,056个脂质组学样品。分析的样品包括人血浆，19种小鼠组织，4种哺乳动物培养的细胞，9种藻类和3种植物，以增加各种生物所特有的脂质亚类的覆盖率（取样策略）（图1）。MS-DIAL 4扩展了数据库中脂质亚类的数量，覆盖了MS-DIAL以前版本的两倍。此外，MS-DIAL 4可以访问以前版本中缺少的决策树注释。总体而言，作者从117个脂质亚类中分离出8,051个唯一性脂质（unique lipids），其中6,570个在分子物种水平上具有特征，包括已确认的酰基链特异性片段。所有结果，包括MS-DIAL源代码、质谱库和半定量值，都可以在RIKEN PRIMe网站（http://prime.psc.riken.jp/）上进行管理。

2.MS-DIAL 4中定量、注释和可扩展性评估

作者使用三个LC-MS研究集对MS-DIAL 4进行了验证（验证方法）（图2）。首先，作者处理了在八个独立平台上使用不同的提取方法、内标和仪器（包括来自Waters，SCIEX，Thermo Fisher，Bruker和Agilent Technologies的仪器）获得的美国国家标准技术研究院（NIST）人血浆脂质组学数据。从八个平台的数据中总共注释了961个唯一性脂质。该结果表明，即使使用相同的数据处理平台、脂质提取程序和质谱机器也会对注释产生实质性影响。与以前报道的数量一样，人血浆脂质浓度范围从100 nM到1μM（图2a）。在血浆脂质种类中，有87％的COD (coefficient of dispersion)估计值<40％（图2b），表明MS-DIAL 4自动化定量在反相LC-MS条件下提供了经过验证的跨实验室脂质组学数据。

其次，在相同的液相色谱条件下处理的来自45个研究的1,412个文件在分子种类水平上解析了108个亚类的4,303个脂质（图2c）。调整保留时间预测模型后，对于外部验证集提供了误差小于1分钟的95％置信区间（图2d）。作者使用验证集估算了错误发现率（FDR）（图2e），发现即使没有RT信息，FDR也保持在<5％。该软件的注释通过使用Bruker timsTOF Pro质谱的PASEF (parallel accumulation–serial fragmentation)数据进行了进一步评估（图2f）。

值得注意的是，MS-DIAL 4是无供应商的代谢组学和脂质组学软件，它支持液相色谱－离子淌度串联质谱（LC-IM-MS / MS）（Agilent，Waters和Bruker）数据的所有数据处理程序。由于离子淌度质谱（IM-MS）有助于利用CCS信息表征代谢物，而CCS信息与RT和m/z构成正交的理化性质（与质量或亲脂性无关），因此离子淌度数据为代谢组学和脂质组学提供更可靠的数据处理平台。使用基于PASEF的脂质组学数据（包括来自16个生物学研究的288个文件），作者使用机器学习技术建立了一个全面的CCS脂质库（图2g）。MS-DIAL 4提供了最全面的资源，其中包含脂质亚类的质量碎片，以及以离子淌度为中心的代谢组学和脂质组学研究的一站式解决方案（图2i–l）。

最后，MS-DIAL 4包含一系列常见于哺乳动物的脂质。该集合包含112个普通脂类和6种特殊脂类，它们包含非常长链的多不饱和FAs16（VLC-PUFA）。层次聚类分析表明小鼠粪便、培养的细胞和小鼠脑组织脂质组明显与其他组织分离，而人和小鼠血浆，小肠和大肠，骨骼肌和心肌以及代谢和免疫器官聚集。除了在大多数组织和细胞中检测到并在其他软件程序中表征的常见脂质亚类外，该平台还揭示了组织特异性脂质。例如，粪便中有许多独特的脂质亚类，反映了微生物组特异性脂质。

图2 | MS-DIAL 4中定量、注释和可扩展性评估

本文脂质组学平台以较小的FDR（<2％）促进了脂质多样性的发现，并将能够表征特定脂质的生理作用和表型调节机制。尽管仅通过基于MS的间接证据来表征包括AHexCer和ADGGA在内的几种脂质亚类，但该信息将有助于注释未知脂质，其结构最终将通过认证标准进行确认。此外，MS-DIAL 4中提供了以前未知的脂质（例如ASM脂质亚类），当与其他组学数据和MS成像技术整合时，它们可能会揭示新的脂质通路。总体而言，MS-DIAL 4改进了标准化的脂质组学程序，从导入原始质谱数据到导出mztab-M格式，并遵循LSI分类、命名和半定量定义，有助于统一脂质组学跨实验室的数据以加速脂质研究。

本文介绍了MS-DIAL 4，这是一个具有保留时间、CCS和串联质谱信息的全面脂质组图谱。作者制定了涵盖117个脂质亚类的脂质质谱碎片图谱，并包括离子淌度串联质谱法。使用人类、鼠类、藻类和植物的生物样品，通过MS-DIAL 4注释和半定量了8051种脂质，估计的错误发现率为1-2％。MS-DIAL 4有助于标准化脂质组学数据并发现脂质通路。

脂质组学作为系统生物学研究中一门新兴学科, 其通过对体液、组织或细胞的脂质组进行系统研究，揭示脂质在各种生命活动中的作用机制，识别代谢调控中关键的脂生物标志物。尽管已有很多脂质方面的研究，但其相关技术手段还存在诸多挑战。其中之一是脂质定性和定量分析的软件还相对薄弱，特别是自动化分析软件和脂质组数据库还相对较少。本文开发的脂质组平台MS-DIAL 4提供了脂质组学数据处理的一站式解决方案，有助于推进脂质组学的研究。

参考文献：

Tsugawa H , Ikeda K , Takahashi M , et al. A lipidome atlas in MS-DIAL 4[J]. Nature Biotechnology, 2020(Suppl.):1-5.

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云起 撰文  

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