【讲座回放】揭露——4D-DIA联合代谢组技术为什么正在快速影响医学研究？

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母离子是肽段经过离子源电离产生的带电离子，也称前体离子，未经过碰撞池碎裂。

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DIA是非标定量中的一种技术，对大队列样本的定量分析最为合适。如果只是想对某种物质进行定性研究则可选择DDA采集模式。

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这得益于timsTOF Pro双tims的设计及超高的扫描速度。肽段经过色谱分离进入质谱后，第一个tims进行累积，第二个tims进行分批释放，两者同时进行。所以离子进入质谱到最终被采集没有丢失，实现了100%的离子利用率。

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PPT中DDA鉴定到的数量是通过高pH预分离成10个组分做的混合建库，不是单针建库，单针建库的数量较少，库容量对DIA的鉴定有较大影响，所以通常我们会尽量多做几个组分来扩大库的容量。

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因为在常规做DIA实验时，我们会采用分级建库得到DDA数据库；而DIA是对样本进行单针扫描得到的，因此DIA检出的蛋白相较于库会少些，但对比单针DDA鉴定量还是有较大提升。

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因为在常规做DIA实验时，我们会采用分级建库得到DDA数据库，此次测试中库是7478个蛋白，而DIA是对样本进行单针扫描得到的，因此DIA检出的蛋白相较于库会少些，但对比单针DDA鉴定量还是有较大提升。

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在29页PPT中，分析样本为Hela，Yeast和E.coli的混合物。单针平均可鉴定8000个蛋白，进行蛋白鉴定的时候，DIA数据分析是基于已有谱图数据库进行分析的，已有数据库中蛋白已经分别归属到Hela，Yeast和E.coli。

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相较于同类型质谱，timsTOF Pro主要有三大特色：

1.仪器灵敏度高，常规Hela上样200ng  2h的梯度就能鉴定超过5000个蛋白；

2.仪器扫描速度快，为实际样本分析扫描速度最快的质谱仪（>120 Hz）;

3.仪器稳定皮实，抗污染能力强，稳定性高。

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做PTM分析时，使用常规PASEF采集模式，质谱离子选择还是依照常规DDA模式进行母离子选择，PTM鉴定依赖软件检索去匹配。

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DDA-PASEF进行母离子选择时，基本原则还是依赖母离子强度由高到低进行选择；timsTOF Pro扫描速度够快，所以进行对于信号低的母离子可重复采集进行谱图叠加。母离子选择和排除由方法里的“target value” 和“intensity threshold”决定。

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timsTOF Pro仪器上进行PRM-PASEF分析时，上样量和 timsTOF Pro常规上样量可保持一致，例如2h梯度一般上样200ng Hela。不过需要指出的是，由于仪器扫描速度快，进行PRM-PASEF分析时，短梯度也可实现高通量母离子靶向分析。

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timsTOF Pro仪器上进行DIA-PASEF分析时，方法设置一般参考样本淌度和质荷比绘制的热图。一般来说，大部分样本多肽的feature分布都比较类似，可使用默认的64个窗口的方法。当然，当遇到一些特殊样本，热图中feature与默认DIA窗口明显不匹配时，还是需要重新编辑的。

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GC-MS和LC-MS一起开展会检测到重复的物质，我们会根据软件打分值人工校正重复的物质，取得分高的物质进行后续分析，提供一份检测报告，大大方便了老师数据挖掘工作。

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蛋白组和转录组测序，从应用领域来看：都可以用于医学、植物学、食品和环境等领域的研究。从应用方向来看：可以用于分子标志物、分子机制、精准分型等。

不过蛋白组是生命科研研究的直接切入点，从蛋白的层面来解释生物学现象。转录组测序，是从mRNA角度探索生物学机制，解释生物学现象。

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