DNA错配修复缺陷型肿瘤抗肿瘤免疫能力增强？这是啥原理？

据统计，50%的免疫检查点治疗响应可以通过肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）来评价，然而仍有50%的高TMB肿瘤患者对免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitor，ICB）无响应或客观缓解率（objective response rate，ORR）低。除上述突变引起的新生抗原外，还发现对ICB治疗不敏感的患者体内T细胞浸润程度低，其原因是未知的。指示泛癌ICB治疗敏感性的标志物有高微卫星不稳定（MSI-H）及DNA错配修复缺陷（dMMR），由DNA错配修复缺陷、微卫星不稳定等原因导致的胞核DNA损伤伴随着胞质DNA的堆积。cGAS-STING通路作为胞质DNA传感器和适应性免疫反应和先天性免疫反应的激活剂，在肿瘤免疫治疗中扮演着重要角色（图1）。

图1.cGAS-STING通路与免疫¹

注：cGAS是一种先天性免疫传感器，可识别多种胞质双链DNA（dsDNA），包括具有病毒、凋亡、外泌体、线粒体、微核和逆转录病毒来源的DNA。肿瘤细胞中，由辐射、顺铂等药物和内源性DNA损伤诱导的急性基因组应激，刺激胞质DNA的产生，并激活cGAS-STING信号通路。cGAS与dsDNA以2:2形成寡聚复合物。cGAS与dsDNA的相互作用通过相变诱导液滴的形成。

今天小编要和大家分享的一篇文章，就是通过构建DNA错配修复缺陷基因MLH1的体内、外敲除模型，用表达OT-I-、HA-表位的肿瘤细胞限制新生抗原产生，探讨1）除TMB诱导的新生抗原外，T细胞缺失在dMMR型肿瘤ICB治疗敏感性中的作用；2）cGAS-STING-IFN信号通路在dMMR介导的胞质DNA传感中的重要作用，以揭示患者ICB治疗耐受的机制，为临床患者的免疫治疗提供依据。

本文于2021年1月11日发表于Cancer Cell杂志，值得注意的是，在本期（VOLUME 39, ISSUE 1, JANUARY 11, 2021）杂志中两篇MLH1相关的研究同时发表，表明MLH1错配修复基因缺失促进cGAS-STING激活、干扰素分泌和T细胞致敏，对于促dMMR癌症的免疫治疗敏感性具有重要参考价值。本文将分享两篇文章中Changzheng Lu²的研究成果。

1. Mlh1是DNA错配修复（MMR）相关基因之一，Mlh1的失活往往导致肿瘤的微卫星不稳定（MSI）。通过CRISPR Cas9方法敲除Mlh1的方法构建体内、外dMMR模型，并检测肿瘤细胞增殖、肿瘤生长及TMB情况，发现：Mlh1的缺失会抑制小鼠肿瘤的生长，同时伴随TMB的增加及新生抗原的产生；缺乏Sting的MLH1缺陷型肿瘤比MLH1缺陷型肿瘤生长快得多。体外功能实验表明，MLH1缺失并没有显著改变肿瘤细胞的增殖和凋亡。

2. 已知肿瘤细胞通过适配器MyD88感知外源性损伤信号，用上述实验中相同的肿瘤细胞构建MyD88缺陷小鼠，结果表明：MyD88缺陷型小鼠和野生型（WT）小鼠瘤体生长并无显著差异。

3. Ⅰ型INF是STING信号通路主要的效应分子，在抗原提呈与DC细胞的激活过程中发挥重要作用。CD103+ DCs是DCs的一个亚群，可以将肿瘤抗原交叉呈递给CD8+ T细胞。因此，在缺乏CD103+和CD8a+ DC的Batf3缺陷小鼠中接种dMLH1肿瘤细胞，发现与对照组相比，Batf3缺陷小鼠对dMLH1肿瘤无抑制作用；而体内消耗CD8+ T细胞后dMMR肿瘤的生长受到抑制，表明CD8+ T细胞对于抑制dMMR肿瘤生长至关重要。

为了考察STING-IFN通路是否与肿瘤细胞dMLH1有关以及如何被激活的。

1.在转录水平采用qPCR检测了IFN诱导基因（Isg15）的表达变化，发现在MLH1缺失型肿瘤细胞（4T1、TC-1、MC38-OVA和B16-OVA）中Isg15的表达显著升高。

2.采用ELISA检测发现MLH1缺失肿瘤细胞培养上清中IFN-β的表达升高。

3.TCGA数据库分析：较微卫星稳定（MSS）的结直肠癌患者，三分之二的MSI患者肿瘤中Isg15高表达。

考虑到突变是dMLH1细胞中的一个持续事件，dMLH1介导的突变可能发生在STING上游的某些基因中，从而增强了STING通路；另一种可能是MLH1本身对STING通路有负调节作用。因为MLH1过表达不会逆转之前生成的突变，因此MLH1回复实验可以区分这两种情况。

1.体内、外研究结果发现：在dMLH1肿瘤细胞基础上过表达Mlh1后，Isg15的表达受到抑制，Mlh1诱导的瘤体生长抑制作用得到缓解。证实了第二种猜想。

2.使用PicoGreen对胞质dsDNA进行了染色，发现dMLH1细胞的胞质DNA阳性百分比显著高于WT细胞；而dMLH1肿瘤细胞过表达Mlh1后，胞质DNA水平回降至初始WT细胞的水平。

为了阐明DNA传感所引起的不依赖于新生抗原的CD8 + T细胞在抗肿瘤反应中的重要作用，

1. 在体内、外构建新生抗原恒定（突变非依赖性的OT-1表位）模型，以排除突变所产生的新生抗原的影响。然后将骨髓衍生的树突状细胞（BMDC）与含OVA表位的肿瘤细胞共培养，使用纯化的BMDC交叉致敏OT-1 T细胞2天，最后检测T细胞的增殖和功能。结果表明，与dMLH1肿瘤细胞预培养的BMDC为有效的单表位特异性T细胞增殖和细胞因子产生提供了有效的激活信号。而Sting缺失则减弱了这种效应。

2. 此外，将Ifnar缺陷的BMDC与dMLH1肿瘤细胞预培养，发现MMR组和MMR缺陷组中T细胞的增殖水平均显著降低，这与体内研究结果一致。即dMMR肿瘤免疫力依赖于树突状细胞中的Ⅰ型IFN信号。

3. 为了更好地了解Ⅰ型干扰素在BMDC介导的交叉致敏作用，在体外将肿瘤上清液添加至共培养体系，在体内将表达OVA蛋白的肿瘤细胞接种到免疫健全的小鼠，检测T细胞的增殖和功能。体外共培养体系中，外源添加OVA蛋白（而非肿瘤细胞）的情况下，将培养的肿瘤细胞的上清液添加到了BMDC和OT-I细胞的共培养系统中，发现肿瘤细胞中MLH1的逆转或Sting的缺乏都会影响T细胞增殖。以上这些作用均不依赖于突变引起的新抗原，因为OT-1 T细胞的增殖仅由来自肿瘤细胞的突变非依赖性OT-1表位或同等水平的、外源添加的OVA蛋白诱导。

综上，dMLH1肿瘤以依赖于肿瘤细胞固有的cGAS-STING通路的方式³激活CD8+ T细胞抗肿瘤反应，但突变引起的新生抗原的激活在此过程中不是必需的。dMMR肿瘤细胞中cGAS-STING通路的缺陷大大减弱了CD8 + T细胞的免疫浸润。

1. 采用免疫健全小鼠构建PDX模型，并用ICB药物处理。结果发现：dMLH1 4T1肿瘤对ICB治疗完全反应，而在MLH1缺陷株基础上过表达MLH1的肿瘤则无此作用。同样，敲除Sting也削弱了治疗效果。

2. 将MC38-OVA细胞接种到TCR转基因2C小鼠中，然后过继转移OVA特异性OT-I T细胞，并给予ICB治疗。发现MC38-OVA小鼠对ICB治疗无效；而MLH1缺失肿瘤起初在无ICB治疗下、T细胞过继性转移后1周内消退，而后复发。因为此模型中，内源性T细胞仅识别肿瘤细胞中不存在的SIY表位（SIYRYYGL），内源性T细胞可以抑制稳态驱动的过继性转移T细胞的增殖。ICB治疗可持续控制MLH1缺失肿瘤的进展。

3. 在4T1-HA动物模型中观察到与MC38-OVA小鼠肿瘤模型相似的结果。

为了探索上述实验室研究成果的临床意义：

1. 细胞实验：选择30株MLH1缺失肿瘤细胞系检测cGAS的表达情况。其中18株cGAS表达缺失；

2. 数据库分析：MLH1缺失与cGAS在患者表达的相关性分析发现，MSI-H组较MSS组cGAS低表达。生存分析得出：cGAS高表达的MSI-H癌症患者预后较好；

3.动物实验：在cGAS表达缺陷株（HCT116细胞）的基础上过表达cGAS，然后接种于人免疫细胞嵌合的NSG-SGM3小鼠，并加以ICB处理。与过表达cGAS的肿瘤相比，cGAS缺陷型肿瘤CD8 + T细胞浸润较少，对ICB治疗的耐药性更强；

4.临床试验：派姆单抗治疗的dMLH1患者中，cGAS或STING高表达预示较好的存活率，同时派姆单抗响应者较未响应者cGAS和STING高表达。除此之外，还分析了已报道的接受抗CTLA4治疗的黑色素瘤患者研究队列，发现cGAS高表达患者预后较好；由于在该队列中黑色素瘤患者几乎没有MMR缺陷，因此此分析并不能明确cGAS高表达与MMR缺陷黑色素瘤患者预后的相关性。

综上，文章亮点在于：

1.一直以来，新生抗原的产生被认为是ICB治疗不敏感的原因，本文报道了T细胞缺失可能是影响ICB治疗的重要因素之一；

2.dMMR肿瘤细胞中DNA传感与新生抗原都增加，当两因素同时存在时，并不能区分DNA传感在其中的作用。使用表达OT-I或HA表位的肿瘤细胞固定新抗原的水平，并通过在体内外导入这些表位特异性T细胞来评估dMLH1介导的DNA传感在抗肿瘤T细胞反应中的作用。

本文着重研究错配修复基因MLH1在肿瘤免疫检查点阻滞剂治疗当中的作用及机制，功能实验较多，而另一篇会从核酸外切酶1的角度进行探讨。欢迎有兴趣的小伙伴前来索取文献。

【参考文献】

1. Kwon J, Bakhoum SF. The Cytosolic DNA-Sensing cGAS-STING Pathway in Cancer. Cancer Discov. 2020 Jan;10(1):26-39.

2. Lu C, Guan J, Lu S, Jin Q, Rousseau B, Lu T, Stephens D, Zhang H, Zhu J, Yang M, Ren Z, Liang Y, Liu Z, Han C, Liu L, Cao X, Zhang A, Qiao J, Batten K, Chen M, Castrillon DH, Wang T, Li B, Diaz LA Jr, Li GM, Fu YX. DNA Sensing in Mismatch Repair-Deficient Tumor Cells Is Essential for Anti-tumor Immunity. Cancer Cell. 2021 Jan 11;39(1):96-108.e6.

3. Guan J, Lu C, Jin Q, Lu H, Chen X, Tian L, Zhang Y, Ortega J, Zhang J, Siteni S, Chen M, Gu L, Shay JW, Davis AJ, Chen ZJ, Fu YX, Li GM. MLH1 Deficiency-Triggered DNA Hyperexcision by Exonuclease 1 Activates the cGAS-STING Pathway. Cancer Cell. 2021 Jan 11;39(1):109-121.e5.