15分钟能鉴定出多少磷酸化位点？ -DIA方法为高通量磷酸化蛋白质组学提供新工具

蛋白质磷酸化（phosphorylation）是蛋白质最为重要的翻译后修饰之一，它可以通过改变蛋白质的活性、亚细胞定位、互作关系和稳定性来影响蛋白质的功能，此外，磷酸化的调节还被认为参与了癌症以及其他疾病的相关的信号通路，因此，对蛋白质磷酸化修饰（包括其修饰位点）的研究一直是一个热点和难点。近日，来自丹麦哥本哈根大学（University of Copenhagen）的J. Olsen课题组在Nature Communications上发表了基于数据非依赖型（DIA）质谱采集的方法的快速磷酸化蛋白质组学工作流程，将单针数据的采集时间，控制在15分钟以内，为磷酸化蛋白质组学在临床上应用提供了新的思路。

在现有的磷酸化蛋白质组学工作流程中，为了达到尽可能高的分析深度，除了针对磷酸化多肽的富集之外，还有繁琐的样品分组（Fraction）步骤，通常需要花费多天，甚至一周时间，限制了其在临床上的应用。为了实现高通量，高准确性的磷酸化蛋白质组学分析，Olsen课题组首先在现有的DIA采集方法的基础上，以15分钟的液相分离时间为基准，对质谱的DIA数据采集方法进行了优化。针对实验中采用的Thermo QE HF-X仪器的特点，该课题组对碰撞能量、临近窗口宽度（DIA窗口的重叠部分）、扫描周期、HCD分辨率等参数进行优化，获得了最优的质谱采集参数。并以起始量为200ug的多肽为测试样品，分别采用DDA和DIA的数据采集方法进行了测试，在数据分析过程中，针对DIA数据，还分别使用的直接DIA（directDIA，注解1 ）和传统的基于图谱库（spectra library）的DIA方法进行了分析（图1. a）。从结果中可以看出，DIA方法在磷酸化多肽鉴定数（磷酸化位点多出近2倍，近28000条磷酸化多肽）、重现性上（R² 0.93 vs 0.89）均胜过DDA方法（图1. b - f），尤其值得指出的是，DIA方法的动态范围为DDA方法高出一个数量级（图1. e - f）作者推测是由于DIA方法对离子的利用率更高，以其仪器参数中MS2 target value的设置（图1.  g-h）。

图1 | a-h DDA与DIA实验结果比较

随后为了继续比较DIA方法与DDA方法在定量准确性上的表现，作者将预设好比例的酵母磷酸化多肽掺入Hela多肽（作为背景）中，以同样的实验流程进行数据采集，在数据分析过程中，分别采用MaxQuant软件（MQ, DDA分析）和Spectronaut软件(SQ, DIA分析)进行了分析，并利用脚本对结果进行处理以方法比较（图2. I）。从实测比值（图2. j）、错误率（图2. K）和ROC图（图2. I）可以看出，DIA方法的表现也优于DDA方法，尤其是当样品浓度较高时（2:1），这对于临床样品有十分重要的意义。

图2 | i-l DDA与DIA实验结果比较

磷酸化数据的分析还有一个额外的难点，就是针对磷酸化位点的定位。针对DIA采集方法中存在的特点（母离子隔离窗口较宽），作者开发了一套的PTM localization算法以准确的定位磷酸化位点。简单的说，该算法首先针对所有质谱峰（peak groups）进行检测（detecting）和分类（classifying），随后采取枚举（enumerate）方法将其分配给可能位点，结合其他信息，该算法将子离子划分为对该位点的肯定（confirming）或否定（refuting）离子，最后，计算所有肯定离子得分并扣除否定离子得分，获得最后的得分（图3）。为了验证该算法，作者将人工合成的磷酸化多肽（位点已知）作为测试样品，采用优化后的实验流程进行了分析（图3）。从测定结果可以看出，DIA方法的错误率更低，准确率更高。目前该算法已经整合入Spectronaut软件中，兼容了DIA工作流程。

图3 |  PTM Localization算法图例与实验结果

随后作者将该流程应用到细胞信号通路研究，以视网膜色素上皮细胞（Retinal pigment epithelium, RPE1）为实验对象 ，使用不同的不同MEK激酶抑制剂（MEK kinase inhibitors）与RPE1细胞反应以诱导产生相应的信号通路。采用DDA和DIA方法采集的数据通仍然通过MQ软件与SQ软件进行分析，此外，在DIA数据分析过程中还增加了不同的分析方法，除去directDIA方法外，针对基于图谱库的数据方法，还选取了不同的图谱库，包括基于DDA数据建立的项目专属图谱库（Project specific library），基于现有图谱的公共图谱库（Community based library）和两者整合的图谱库（Combined library）（图4）。从结果中可以看出，DIA的整体结果均好于DDA结果（除了directDIA与DDA接近）（图4. b），而从热图（图4. c）和模体（motif）富集分析（图4. e）中可以看出, DDA与DIA鉴定出的磷酸化蛋白质/位点模式相似，富集的位点也相似，均与该信号通路的结果一致，验证了该方法的可靠性。随后，作者还将该方法推广至磷酸化位点的化学计量学（stoichiometry）分析和更大规模的激酶抑制实验中，均验证了该方法的可靠性和可扩展性。

图4 | 信号通路验证试验

在最后的讨论中，作者指出该方法（包括质谱采集参数和磷酸化位点定位算法）已经整合入DIA数据分析流程中，并通过实验证实了该方法的性能优于DDA方法。并且由于DIA方法在灵敏度上优势，该工作流程的样品起始量可以比200ug更低，更符合临床研究的需求。

注解：

directDIA是指在数据分析过程中，DIA的数据经过去卷积后，与基于蛋白质序列的数据库（database）进行比较，而不是DIA常用的图谱库（spectra library）。

1.该论文所采用的质谱仪器为Thermo QE HF-X, 该型号仪器在鹿明实验室已经稳定服役了多位老师的科学研究，已经协助多位客户发发表了科研论文。

2.该论文所使用的DIA技术被引入鹿明实验室了，可为实验中不同仪器（包括Thermo QE HF-X和Bruker timsTOF Pro）提供DDA/DIA数据分析，欢迎老师尝试DIA/基于timsTOF Pro的4D-DIA（PASEF-DIA）哦~~

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上海鹿明生物科技有限公司多年来，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过多年的发展沉淀，公司建立起了4D-DIA/LFQ/PRM、iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组、精准靶向等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。同时鹿明生物的蛋白组学，代谢组学技术广泛应用于疾病标志物发掘、分型诊断、精准用药、药代药动、药物表征等多个领域。

参考文献：

D. B. Bekker-Jensen et al., Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries. Nature Communications 11,  (2020).

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茯苓 撰文

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