2021-03-03 19:38:38, 吴小燕 美谷分子仪器(上海)有限公司
本文字数:1895字
阅读时间:6分钟
视频时长:6分44秒
01
报告基因法
报告基因法是通过分子生物手段将报告基因整合入待测的生物系统中,继而通过检测报告基因产生的信号,研究特定生物学过程的方法。在实际操作中通常是将报告基因与目的基因或调控序列连接,如将报告基因置于特定启动子调控序列之后,研究某种条件下启动子的调控或特定基因调控下目的蛋白的表达。作为报告基因,其序列和功能通常已知且其表达产物易于被检测。
报告基因的种类很多,根据对其表达产物的分析检测方法的不同,可将其分为体外报告基因和体内报告基因。体内报告基因的分析需要在含有报告分子的细胞裂解液或者细胞/组织培养液中进行,此类报告基因为分泌性报告基因,如氯霉素乙酰基转移酶基因(CAT)、人生长激素基因(hGH)及分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)等。体外报告基因则可以在活的细胞或组织中进行,如绿色荧光蛋白基因(GFP)。而 β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)和萤火虫荧光素酶基因既可以在体外分析也可以在体内分析。
各种报告基因的优缺点
报告基因
优点缺点
CAT
在哺乳动物中没有内源性活性;可用自动化的 ELISA 方法检测
线性范围窄;灵敏度相对较低;需要使用放射性同位素
β-Gal
蛋白稳定;生物或化学发光检测灵敏;不需要使用同位素
在哺乳动物细胞中有内源性活性
hGH
属于分泌型报告蛋白;操作简便
灵敏度相对较低;线性范围较窄
SEAP
化学发光检测法非常灵敏;线性范围较宽;价格便宜
在某些细胞中具有内源性表达;与筛选的化合物相互干扰
Luciferase
灵敏性好;线性范围宽;没有内源性表达;测定方法简便
蛋白的半衰期较短;常规分析重复性差
GFP
自发荧光(不需要底物);没有内源性表达;有多种突变体可应用
需要翻译后加工;敏感性较低(没有信号的放大)
02
报告基因法在药物活性筛选中的应用
药品有效性必须是疗效确切,且含有特定的有效活性成分及一定的浓度含量。在药物研发的过程中,为了评价药物的有效性和临床应用价值,生物学活性的测定是重要的手段之一。现阶段的生物学活性分析方法主要是在体外检测,大多以细胞为基础进行研究。近年来,随着生物药物的快速发展,报告基因法逐渐应用于生物药的生物学活性检测之中。通常是在充分理解药物分子药理机制的基础上,构建相应的细胞模型,通过激活待测药物参与的信号通路产生生物效应,从而反映药物的生物学活性。
以干扰素为例,早在 2015 年版的《中国药典》中,报告基因法就已被收录为 Ⅰ 型干扰素活性测定的标准方法之一。除干扰素外,重组人促红细胞生成素,促胰岛素分泌肽融合蛋白,血管内皮生长因子抗体,程序性凋亡受体 Ⅰ 型抗体等生物制品也相继建立了报告基因的生物学活性检测方法。
药物
信号通路
生物学活性
报告基因
干扰素
干扰素刺激应答元件
抗病毒/抑制细胞增殖/免疫调节
荧光素酶/绿色荧光蛋白
肿瘤坏死因子α
核内因子
免疫调节
荧光素酶
重组人促红素
sis 诱导元件和 γ-干扰素应答元件
促进细胞增殖
荧光素酶
生长激素
生长激素应答元件
促进细胞增殖
荧光素酶 /β-半乳糖苷酶
促甲状腺激素
cAMP 应答元件
调节细胞代谢
荧光素酶
白细胞介素 1
核内因子
免疫调节
荧光素酶
抗 CD-20 抗体
核内转录因子
抗肿瘤
荧光素酶
注:该表仅列举了部分典型药物的生物学活性检测方法。
03
报告基因法用于生物活性检测的优势
● 快速——上表中列举的各个生物制品相关的报告基因法检测均可在 1 天内完成,相较于传统的方法大幅的提高了工作的效率。例如传统的噬斑法研究干扰素活性,从病毒的感染到观察到细胞病变,至少需要 2 天的时间。
● 方法变异度小——以抗血管内皮生长因子 VEGF 抗体的生物学活性检测为例,报告基因法的精密度和准确性都比较高,变异系数 CV 小于 10%,而传统的人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖法精密度和准确性的 CV 则只能控制在 15% 以内。变异度越小就意味着检测结果更加真实可靠。
● 反映药品生物学活性的分子机制——中国药典指出,药物活性的检测方法要尽可能反映或模拟药物预期的作用机制。一个成功的报告基因活性检测方法,正是利用了药品活性相关的信号通路,从而能够直观的反映药物的作用机制。
04
如何使用 SoftMax Pro 软件
设置报告基因检测的方法
下面的视频以最常见的荧光素酶和 GFP 报告基因介绍软件的设置方法
*视频时长:6’44”
**流量预警:38.7MB
以荧光素酶报告基因的检测为例,在软件内单击 Setting,依次选择 LUM,Endpoint,
Wavelength:勾选 All,
Plate type:选择相应的孔板并选择标准的非透明板
Plate Area:根据样品的点样位置进行选择
PMT and Optics:根据试剂盒说明选择 Integration Time
Shake:如需在读数前对微孔板进行震荡,则勾选并修改震荡时间
对样品的分组进行设置,需
在 Series 界面内选择样品排列方向,X/Y 轴方向的重复数量,起始浓度和稀释倍数/方式(加减乘除),以同样的方式设置其他样品分组,通过 Add/Delete/Edit 可以对已有的分组进行删减和编辑(名称和单位)。
若是以 GFP 作为报告基因,则在 setting 中选择 FL 和 Endpoint
Wavelength:Excitation 488nm,Emission 510nm
Plate type:选择相应的孔板并选择标准的底部透明板(由于底读的需求)
Plate Area:根据样品的点样位置进行选择
PMT and Optics:PMT Gain 选择 Automatic;勾选 Read from Bottom
Shake:如需在读数前对微孔板进行震荡,则勾选并修改震荡时间。
样品分组设置方法参考前述介绍内容,设置完成后
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