【多组学深度解读】客户文章 | 西南科技大学运用多层组学整合分析对植物铀毒性机制研究

2019年10月，欧易/鹿明生物合作客户西南科技大学环境与资源学院罗学刚教授团队在一区期刊Journal of Hazardous Materials（IF=7.650）发表题为“植物铀毒性机制的代谢、转录组分析和矿物质营养代谢研究”的文章。该文章作者通过整合GC-MS和LC-MS非靶标代谢组、转录组测序数据，对蚕豆根系在不同浓度铀胁迫下的微观结构、营养代谢等方面进行了全面而系统的研究，揭示了铀对植物根系的毒性作用机制。

英文标题：Metabolomic, Transcriptomic Profiling, and Mineral Nutrient Metabolism Study of the Phytotoxicity Mechanism of Uranium

中文标题：植物铀毒性机制的代谢、转录组分析和矿物质营养代谢研究

材料：蚕豆根系

影响因子：7.650

发表期刊：Journal of Hazardous Materials

运用欧易/鹿明生物技术：UPLC-MS普筛、GC-MS普筛、转录组测序

铀（U）是一种具有高放射性和长半衰期的典型工业污染物。土壤和水中的铀可通过食物链进入人体，也容易被吸收并积累在生物体组织中。组织中的铀会释放射线，对细胞造成不可逆的内部辐射损伤。因此如何处理受铀污染的土壤和水已成为迫在眉睫的环境问题。目前已经开发了多种铀修复技术，其中生物修复（尤其是植物修复），具有原位、易于使用和成本低廉的优点，植物作为一种超蓄积剂已成为理想的铀修复方法。但是铀为非必需元素，高浓度铀的植物毒性会导致根部变黑和坏死并抑制茎叶生长，进而造成铀提取的效率显著降低。因此需要了解铀的植物毒性机理，以提高利用超蓄积剂修复铀污染的效率。

这篇文章中，作者选择了毒理学研究的示范植物——蚕豆（Vicia faba）作为实验材料，来探索铀的植物毒性机理。

1.实验分组

使用硝酸铀酰（238U，UO₂（NO₃）₂·6H₂O）做铀源，在其它条件相同但铀浓度不同的情况下，处理幼苗72小时。同时在叶子上喷洒磷酸盐溶液（KH₂PO₄，0.1 mM）以防止植物出现磷缺乏的症状。铀浓度分别为：0μM（对照），5、10、15、20和25μM。

2.检测方法

（1）植物生长量测量

幼苗分为地上部分和根，干燥至重量不变，测量地上部分和根生物量，每种处理重复三次。

（2）根微结构分析

选择对照组（0μM）和高浓度铀（25μM）处理组的植物根（茎根和侧根）做石蜡切片（根横切，厚度为3-4μm），使用光学交互式显微镜确定牙根结构的变化。使用透射电子显微镜观察铀在根细胞的亚细胞分布（放大倍数1-4 k）。使用能量色散X射线光谱法分析植物亚细胞结构中的元素类型。

（3） 矿物质含量分析

微波消解植物样品后使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测铀含量。使用火焰原子分光光度计检测钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铁、锰（Mn）、锌（Zn）、铜（Cu）和钠（Na）的含量。通过钼锑比色法测定钼含量。所有试验进行三次生物学重复。

（4）非靶标代谢轮廓分析

选择对照组（0μM）和高浓度铀（25μM）处理组的植物根，进行GC-MS和LC-MS非靶标分析，每组6次生物学重复。差异表达代谢物（DEM）通过OPLS-DA模型的投影值（VIP，大于1.0）、对不同组的标准化峰面积进行的双尾t检验（P值<0.05）进行组合确定的。

（5）转录组测序分析

选择对照组（0μM）和高浓度铀（25μM）处理组的植物根进行RNA测序，每组3次生物学重复。涉及到的软件或数据库有：Diamond软件、Swiss-Prot蛋白序列数据库（Swiss-Prot）、HMMER软件分析。差异表达基因（DEG）的分析程序为group_T（U 25μM）与group_control（U，0μM）。DEGs阈值为基因表达量的倍数变化大于2且p值（或FDR）小于0.05。通过路径分析确定了KEGG数据库中DEG的分布。

1.植物生长和铀累积

随着铀浓度（0-25μM）增加，处理72小时的蚕豆根部逐渐变黑（图1A）。尽管在短期内（少于72小时）蚕豆的生物量影响不明显，但根和地上部分的生物量却呈下降趋势（图1B）。当浓度为5-25μM时，根中铀累积达到164.34至927.90μg每罐，总吸收率达到46.03至55.05％（图1C）。但是地上部分仅为0.028至0.119μg每罐，总吸收率小于0.01％（图1C）。这些结果表明，作为一种有毒元素，铀不易转移到植物的地上部分，而在根中积累，这也是根发黑的直接原因。

图1 | 蚕豆中铀的变化积累效应和对幼苗生长的影响

（A）幼苗生长状况；（B）U对幼苗生物量的影响；C）幼苗中的U含量

注：a-c表示地上部分不同处理之间的显著差异（n = 3）；A-C表示根的不同处理之间存在显著差异（n = 3）

2. 铀累积对根部结构的损伤

为了研究铀积累对根细胞结构的影响，对铀处理（0和25 μM）根的石蜡切片进行分析。结果显示，与对照组相比，铀处理组根组织结构被破坏，且侧根发育明显被抑制（图2 A1，C1）。与对照组相比，铀处理组的侧根表皮组织被破坏（图2 B1，D1）。透射电镜分析结果表明，铀处理组的根细胞壁和细胞间隙附着有致密的沉积物（图2 C2，D2），而对照组没有（图2 A2，B2）。X射线能谱分析的结果证实这些致密沉积物中存在铀（图2E，F）。上述实验结果表明，根细胞壁和细胞间隙是铀积累的主要场所。

图2 | 铀处理对蚕豆根细胞结构的影响

图A1-D1植物的石蜡切片（5倍物镜），红色圆圈表示在40倍物镜下观察到的植物结构；图A2-D2根细胞的超微结构（×1k），红色圆圈表示在TEM的4000倍观察到的植物的超微结构。图E和F分别是图C2和D2中沉积物EDX的结果。

3.铀引起矿物质代谢异常

不同浓度铀会显著干扰幼苗的矿物质代谢（图3）。

图3 | 铀对蚕豆幼苗不同矿质含量的影响

注：条形图顶部的数字表示幼苗中矿质元素的转移系数；

*表示铀处理的矿物质元素含量与对照组相比有显著差异（P <0.05）（n = 3）。

常量元素部分：幼苗地上部分、根和整株植物中的磷（P）含量分别下降了8.08–13.33％，17–38.86％和10.75-24.74％（图3A），表明铀明显干扰了幼苗对磷元素的吸收和转运。铀对钾、钙和镁的代谢具有相似的作用，表现出相似的吸收和转移模式。根部和整株植物中钾，钙和镁的含量增加，而地上部分中这三种元素的含量则随着铀浓度的增加而降低。因此随着铀浓度增加，三种元素的传递系数逐渐减小（图3B–D）。

微量元素部分：根中高浓度铀也会阻碍微量元素向地上部分转移。铀会抑制根部吸收Fe、Mn、Zn、Cu和Na（图3E-I），抑制率分别为1.43-11.20％，36.15-64.28％，2.69-9.52％，21.21-49.13％和12.14-28.35％。另外微量元素在地上部分的含量和转移系数呈现出先增加后减少的趋势。

为了更加清晰地展示铀与矿物元素之间相互作用关系，使用了主成分分析方法，结果如图4A所示。在PCA得分图中，随着铀浓度的增加（0-25μM）矿质元素信息组的位置发生明显变化，说明铀处理过程中植物的矿质营养代谢明显被干扰，干扰程度与铀浓度有关。根据权重网络图（图4B）所示，尽管铀与P、Na和Cu表现出显着相关性，但P与其他矿物质元素的关联性最高，表明P是矿物质代谢调控网络的枢纽。以上结果清楚地表明，铀暴露导致幼苗的矿物质代谢特征发生变化，尤其是P的代谢特征，这表明P代谢异常可能是植物生长异常的主要原因之一。

图4| 蚕豆幼苗代谢的主成分分析（A）得分图和加权网络图（B）

注：图（B）中不同圆形节点代表不同的矿物元素，节点的数据表示不同矿物质元素含量之间的相关系数；*表示0.05水平差异显著，**表示0.01水平上差异显著。

4.铀积累对根代谢组表达产生不利影响

作者使用GC-MS非靶向代谢组学定性出184种代谢物，其中有68种表达有显著差异（VIP> 1和P <0.05），包括26种表达上调和42种表达下调的代谢物。这些差异代谢物（DEM）主要是碳水化合物（23.53％）、有机酸（23.53％）和次生代谢途径（20.59％）（表1）。使用LC-MS非靶向代谢组学鉴定出5,090种代谢物，其中有544种表达有显著差异（VIP> 1和P <0.05），包括283种表达上调和261种表达下调的代谢物。LC-MS非靶向平台的差异代谢物主要为脂质（46.69％）、次生代谢产物（33.27％）和有机氧化物（6.62％）（表1）。

表1 铀处理后蚕豆幼苗根部表达有差异的代谢产物

将差异代谢物富集到KEGG途径后发现，GC-MS非靶标代谢技术发现的差异代谢物主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径、三羧酸循环（TCA循环）、碳代谢、乙醛酸和二羧酸酯代谢、氨基酸生物合成和丁酸酯代谢途径中（图5）。LC-MS非靶标代谢技术发现的差异代谢物主要集中在类固醇生物合成、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、三羧酸循环（TCA循环）和嘌呤代谢途径中（图5）。这些发现表明，铀的积累会严重干扰植物的基本代谢途径，例如呼吸和脂质代谢以及氨基酸代谢和核苷酸代谢，并且会激活植物的生理途径，导致非生物胁迫下次级代谢产物的积累。

图5 | KEGG途径中差异表达代谢物富集途径的可视化分析

注：气泡图展示了排序前20位的KEGG富集途径，代谢途径根据P值从大到小排列，值越小，意义越大。

5.铀积累对根转录组表达产生不利影响

转录组测序结果显示，在铀诱导下根中检测到4,974个差异表达基因（DEG），包括1,654个显著上调基因和3,320个显著下调基因（图6A，B）。DEG通过KEGG进一步富集、分类，结果表明DEGs分布在细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和新陈代谢中。

图6 |蚕豆差异表达基因的热图分析（A）、统计结果（B）和KEGG分类结果（C）

注：差异表达基因的筛选条件是倍数变化大于2且p值小于0.05

大多数DEG集中在代谢过程途径（图6C），上调基因主要在苯丙烷生物合成（n = 27）、药物代谢（即细胞色素P450）（n = 14）、细胞色素P450（n = 14）、谷胱甘肽代谢（n = 17）和酪氨酸代谢（n = 10）。此外结果表明，上调基因在氨基酸生物合成、脂质代谢和次级代谢途径中显著富集（图7）。下调基因主要集中在光合作用-天线蛋白（n = 34）、光合作用（n = 40）、戊糖和葡萄糖醛酸酯互变（n = 27），、亚油酸代谢（n = 13）和胞间连丝（间隙连接）（n = 18）途径中。下调基因在与细胞分裂，细胞周期和碳代谢有关的途径中显着富集（图7）。以上结果表明，高浓度铀对植物基础代谢途径（如碳和氮代谢）有明显干扰。此外作者发现，铀引起的非生物胁迫激活了植物的生理途径，例如细胞色素P450诱导和苯丙烷类次生代谢产物的积累。

图7 | KEGG途径中差异表达基因富集途径的可视化分析

注：气泡图显示了排序前30位的KEGG富集途径。筛选条件是该途径具有不同单基因且数目大于2。根据每个途径的p值，KEGG富集途径从大到小排列，p值越小意义越大。

6.铀诱导的胞间连丝途径功能障碍

胞间连丝充当了物质运输（例如离子，氨基酸和核苷酸）、次级信号分子运输以及植物细胞之间信息转移的通道。胞间连丝相关的结构蛋白与间隙连接蛋白同源，有报道在植物中发现了一些类似于动物间隙连接蛋白的结构蛋白。

在本研究中，高浓度铀会显著抑制与胞间连丝途径相关基因的表达，包括ras样蛋白基因、丝裂原激活的蛋白激酶激酶基因、微管蛋白α链基因和微管蛋白β链基因。在铀处理下Ras样蛋白、蛋白ras-2、微管蛋白α-2链、微管蛋白β-5链和微管蛋白β-1链基因的表达水平，被显著抑制了3倍以上（表2）。结果表明胞间连丝功能异常可能会干扰植物的基础代谢过程。

表2 胞间连丝途径中DEGs的鉴定

结合代谢组学研究结果可以发现，铀积累可显著降低多种游离氨基酸、核苷酸及其类似物的含量。酵母氨酸、色氨酸、赖氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酰酪氨酸、丝氨酸和氨基戊酸的含量显著降低，而谷氨酸和鸟氨酸的含量在铀处理条件下增加（图8A-C）。苯氨基腺苷、2''-O-甲基-腺苷、5''-脱氧腺苷、肌苷-5''-单磷酸、脱氧鸟苷、3-脱氧-鸟苷、二甲基-鸟苷、2''-脱氧鸟苷和胸苷的含量也明显降低，而腺嘌呤和FMNH2在铀处理条件下含量增加（图8D-F）。

图8 | 在铀诱导下鉴定差异代谢物中的氨基酸和核苷酸

注：图A-C显示已鉴定氨基酸的显著差异，图D-F显示已鉴定核苷酸的显著差异。

*表示在0.05水平上有显著差异。**表示在0.01水平上有显著差异。

结合转录组研究结果可以发现，铀显著干扰无机离子转运蛋白相关基因的表达。如图9A和B（热图和得分图）显示，暴露于高浓度的铀（25μM），无机离子相关基因的表达模型的PC1明显分离，并可解释79.7%的数据变化。随着铀浓度增加，PCA图中无机离子相关基因位置明显有变化，这表明高浓度铀明显干扰了无机离子相关基因的表达。就常量元素而言，铀积累显著改变了与根中氮、磷、硫、钾、钙和锰的运输和代谢相关基因的表达方式，可能导致这些矿质元素的代谢失衡。关于微量元素，铀明显干扰根中与Cu和Fe转运和代谢相关基因的正常表达模式，其特征表现为Cu分子伴侣、Cu转运蛋白、Fe2+转运蛋白和相关酶基因的异常表达，可能导致Cu和Fe在植物中代谢失调。另外其他微量元素（例如Mn、Zn和Na），无机离子迁移和无机离子代谢以及金属硫蛋白样蛋白基因、植物螯合素合成酶基因、硒结合蛋白基因、谷氨酸门控离子通道以及碳酸酐酶基因的表达模式也受到干扰（图9C）。上述干扰可能导致植物异常的无机离子运输和代谢。

图9 | 热图（A）、主成分分析得分图（B）和无机离子迁移和蚕豆幼苗中差异表达基因的分类图（C）

7.铀诱导的色氨酸代谢和生长素信号转导途径功能障碍

铀元素可以显著干扰色氨酸代谢和植物生长素信号转导途径（图10）。统计分析结果表明，色氨酸代谢途径和生长素信号传导途径中的三种代谢产物（血清素、黄体酸和吲哚乙酸）显著下调，同时在该途径检测到27个差异基因（图10A-C，上调n = 8，下调n = 19）。

图10 | 铀元素对色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径代谢产物和基因表达的影响

图（A）生长素信号传导的途径；图（B）色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径差异代谢基因的统计结果；图（C）显示差异基因在色氨酸代谢途径和生长素信号转导途径的表达。

注：圆圈代表代谢产物，方框代表调节基因。红色表示基因表达被上调，而绿色表示基因表达被下调。黄色表示该家族基因中既有上调基因又有下调基因。

高等植物中吲哚乙酸（IAA）的合成主要通过吲哚丙酮酸途径进行，吲哚-3-乙醛氧化酶是该途径中的关键酶。铀可以显著抑制吲哚-3-乙醛氧化酶的基因（0.87倍），并且导致IAA含量显著降低（0.55倍）（表3和图10C）。实验结果表明，生长素介导的信号转导涉及的差异基因被映射到KEGG，铀诱导的植物生长素含量降低，铀显着抑制生长素转运蛋白样蛋白基因、生长素反应蛋白基因和生长素反应因子基因在信号转导途径的表达。它还导致吲哚-3-乙酸酰胺基合成酶GH3基因和生长素反应蛋白SAUR基因发生变化（图10A和表3）。因此根中铀积累会干扰生长素信号转导途径，并最终导致蚕豆根系生长受到抑制。前面提到的潜在机制可能是蚕豆铀毒性的基础。此外在调节侧根发育中起重要作用的快速碱化因子（RALF）家族基因的表达被显著下调（3.16倍），这一发现可以解释铀诱导的蚕豆侧根发育受到抑制的现象。

表3 色氨酸代谢和植物生长素信号转导通路中差异基因的标注

8.磷含量与铀的相互关系

矿物营养代谢可以与重金属代谢过程相互作用，共同调节重金属的吸收、分布和运输以及生理应激反应过程。植物通过调节细胞中阴离子和阳离子的含量，以维持电中性环境，平衡的离子组成和代谢活性。但是这种平衡很容易受到非生物胁迫的干扰。本研究结果表明植物中磷含量和铀存在明显的相互作用。较高的铀浓度会显著降低植物中的磷含量，并抑制磷相关转运蛋白基因的表达，例如无机磷酸盐转运蛋白（图3、9）。同时高浓度的铀也干扰了蚕豆离子组，导致矿物质营养代谢的失衡。

9. 铀破坏胞间连丝功能

先前的研究表明，细胞壁中高浓度铀会明显干扰植物根系对矿质元素的吸收和运输。本研究发现在细胞壁中积累的铀严重破坏胞间连丝，胞间连丝是游离氨基酸、核苷酸和无机离子的转运通道。通过对胞间连丝的损害，矿物质营养素、氨基酸和核苷酸代谢受到不利影响，直接导致相关代谢物的失衡（图4、8、9）。铀对矿质养分代谢和相关功能基因表达模式的影响可能解释了铀诱导的植物毒性。同时植物对矿质元素的吸收主要通过质膜和共质体途径，这些元素会通过根细胞的细胞间隙。研究发现在植物根中，铀容易被吸附并造成明显损害。机制之一是高浓度铀对元素中涉及的转运蛋白基因具有显著抑制作用，导致铀在根部被阻断。

10.植物根对铀的生理应激代谢机制

铀诱导的胁迫通过辐射毒性、离子毒性、渗透胁迫和次级氧化胁迫影响植物的生长。先前的研究表明，植物通过一系列生理和分子机制适应了胁迫环境，应对压力的防御机制包括调节功能基因的转录、激活与压力相关的基因途径（例如，P450代谢途径和次级代谢途径）、合成与压力相关的物质（例如抗氧化、脯氨酸、甜菜碱、谷胱甘肽）并调节相关的代谢途径（例如次生代谢产物，离子转运和氧化还原反应）。本研究中铀处理的样品激活了生理应激相关的应答途径，例如细胞色素P450途径、苯丙氨酸生物合成途径和脂质代谢途径以及其他相关的基因表达途径。该发现表明植物为了响应铀毒性而激活了防御系统。在先前关于拟南芥的研究中，低浓度铀引起根尖的有丝分裂活性增加，诱导了初生根的生长并抑制了侧根的形成。但是高浓度铀抑制了初生根的生长，并诱导了侧根胼胝体和木质素沉积。在本研究中高浓度铀（25 M）显著抑制蚕豆初生根（taproots）侧根生长并明显破坏根表皮组织细胞（图2）。高浓度铀还显著抑制与细胞有丝分裂和碳代谢途径相关基因的表达（图7）。在代谢水平上，铀积累导致各种主要代谢产物（如氨基酸，核苷酸，多糖，脂质和维生素）的含量存在显著差异（表1和图5），表明铀元素诱导了这些物质的代谢失衡，可能是潜在的铀植物毒性机制。

11.铀诱导蚕豆根的生长素信号转导途径损伤

快速碱化因子（RALF）属于多肽生长调节剂，可与植物中的生长素、赤霉素和细胞分裂素等非蛋白质信号分子形成信号网络，从而调节植物的生长发育。之前的研究中，外源添加10nM的合成RALF可显着抑制番茄根的伸长。烟草中Na-RALF表达的下调对于主根和根毛的正常生长至关重要。拟南芥中AtRALF1或AtRALF23基因的过表达抑制了幼苗的生长。在本研究中，RALF34的表达显著下调，可能潜在地减轻了铀诱导的根系结构损害和根系生长发育（图10和表3）。但是铀会显著抑制植物生长素的含量并诱导AUX1，AUX / IAA和ARF基因表达的显着下调。后者可能阻止了TIR1和AUX / IAA的组合，导致生长素应答蛋白的降解延迟。先前的文献报道生长素应答蛋白会抑制ARF转录因子，从而导致ARF转录因子失活和其下游基因的异常表达。在本研究中，GH3和SAUR表达的失衡可能影响了植物的生长（图10和表3）。因此铀诱导的蚕豆根中生长素信号转导途径的损伤可能是潜在的铀植物毒性的机制。

在这项研究中，通过整合代谢组学、转录组学和矿物质营养代谢分析技术，研究植物中铀的植物毒性潜在机制。在幼苗实验中，高浓度的铀导致根部变黑和植株死亡。铀主要分布在根的细胞壁上，破坏微结构并抑制了根的生长和发育。

高浓度铀会导致矿物质营养代谢的失衡以及植物正常代谢和转录组的变化，对胞间连丝功能和生长素信号转导途径有不利影响。研究结果还解释了铀植物毒性的潜在机制。

上海鹿明生物科技有限公司，一直专注于生命科学和生命技术领域，是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀，公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台，并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

公司拥有：

SCIEX-QTRAP-6500,

SCIEX-QTRAP-4000,

Waters Xevo G2-XS,

Thermo-TSQ-Altis,

Thermo-Obritrap-QE,

Thermo-Obritrap-QE-HF,

Aglient-GCMS-7890B/5977A,

AglientGCMS7890B/5977A（带顶空进样装置）

及云计算分析平台等大型检测设备以及完整的样品前处理系统和数据分析系统（拥有各类分析软件及数据库）。

本文系鹿明生物原创

欢迎转发到朋友圈

转载请注明本文转自鹿明生物

点击“阅读原文”看更多精彩