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前言
在离体样本中,不同的存储条件、存储时间等可能会导致生物分子发生不同程度的降解。因此,测量的结果可能不准确,或者无法反应活体内的真实情况。由西湖大学郭天南教授和瑞士苏黎世联邦理工学院 的Ruedi Aebersold教授团队于2019年6月合作发表在《Nature communications》上的文章Comparative analysis of mRNA and protein degradation in prostate tissues indicates high stability of proteins,以前列腺癌临床样本为例,通过SWATH/DIA技术探索对比样本中蛋白和mRNA降解的问题。
基本信息
英文标题:Comparative analysis of mRNA and protein degradation in prostate tissues indicates high stability of proteins
中文标题:前列腺组织中mRNA和蛋白质降解的比较分析表明蛋白质的高稳定性
材料:前列腺癌组织
影响因子:11.878
发表期刊:Nature communications
主要运用技术:SWATH/DIA、RNA-seq
研究背景
准确且精确的测量组织样品中不同类型的分子对于临床诊断,预后和治疗是极其重要的。活体细胞内,生物分子的产生和降解在复杂的调控下保持着平衡,然而离体的样本其平衡被破坏,mRNA和蛋白的降解系统发生了变化,不同的存储条件、存储时间可能会导致生物分子发生不同程度的降解。本文通过RNA-seq和PCT-SWATH技术对前列腺癌组织中mRNA和蛋白的降解进行了探索。
研究思路
图1 | 实验设计
(一)实验分组
1) 验证PIN算法:不同蛋白酶量处理的HeLa细胞(A-F, control);
2)评估组织mRNA和蛋白降解:来自24例前列腺癌患者的68对邻近组织;
(二)检测方法
1) RNA-seq检测转录组;
2) SWATH/DIA检测蛋白质组;
结果分析
1.开发和验证PIN算法
为了表征蛋白降解程度,作者开发了PIN算法。首先用iPIS (individual protein integrity score)表示每种蛋白的降解程度,定义为1减去每种蛋白鉴定到的半胰蛋白酶肽段(semi-tryptic peptides)丰度总和除以该蛋白鉴定到的所有肽段丰度总和(),其中半胰蛋白酶肽段即标准的胰蛋白酶酶切肽段被截短的形式(图2所示),这类肽段可能是由蛋白酶降解蛋白而产生。PIN定义为样本中所有蛋白iPIS的算术平均值。由该定义可知,样本中蛋白降解越少,则PIN值越接近于1。
图2 | PIN算法
为了验证PIN算法,作者用不同量的蛋白酶处理HeLa细胞,产生不同降解程度的样本(图3a),接着用SWATH技术检测样本,并计算每个样本的PIN值。结果可见PIN值随着降解程度的增加而减小(图3b),且PIN值与样本中加入的蛋白酶量呈线性关系(R2:0.94),说明PIN值可精确反映蛋白降解程度。
图3 | 用于验证PIN算法的基准研究
2.mRNA和蛋白质降解的比较分析
为了评估组织样本中mRNA和蛋白的降解程度,作者收集了24例前列腺癌患者的68对邻近组织样本(图3a)。通过PCT-SWATH和RNA-seq检测每对邻近样本的蛋白组和转录组,其中转录组共鉴定到14593种基因,蛋白质组通过建立参考库(前列腺组织的79个DDA数据,共51969种胰蛋白酶肽段和4530种半胰蛋白酶肽段)搜库分析得到由27685种胰蛋白酶肽段和2133种半胰蛋白酶肽段组成的3056种蛋白质。作者通过定量每个基因3''偏差(3′bias)来定义mRIN用以评估mRNA降解程度,在检测的68例样本中发现了13例样本存在mRNA降解(mRIN < −0.04; P-value < 0.01),同时对蛋白的PIN评估发现了4例样本存在蛋白降解(P-value < 0.01),且mRNA降解和蛋白质降解间不存在相关性(r=0.147)(图3b)。其中mRNA降解最严重的五个样品来自两个患者(图3c)。而发生蛋白降解的样本对患者没有偏性(图3d)。
图4 | 临床样本中mRNA和蛋白质降解的比较
为了展示每种mRNA和蛋白质的稳定性,作者分析了mRNA和蛋白的降解谱(图4)。整体而言,可以看到转录组水平的降解程度高于蛋白质组水平的降解。mRNA降解严重的样本中,大多数mRNA都受到了影响(图4a),而相比之下,在所有样品中检测到2384种(78%)蛋白质iPIS等于1,表明检测到的大多数蛋白质不受蛋白质降解的影响(图4b),即使在PIN值较低的样品中,蛋白质降解也是如此,说明蛋白质降解的时特异性更强。
图5 | mRNA和蛋白质降解的可视化图
3. 降解对蛋白质组学测量的影响
作者进一步研究蛋白降解如何影响蛋白质组学的测量及相关临床结论。首先定义iPIS分值小于0.8的蛋白质为降解蛋白,分别对所有蛋白(图5a)及未降解蛋白(图5b)进行聚类分析,发现两组聚类结果高度相似。说明该样本的蛋白质降解对生信分析结果影响不大。此外,胰蛋白酶肽段的重新性高于半胰蛋白酶肽段的重新性(图5c),且由同一蛋白产生的胰蛋白酶肽段间的相关性更强(与半胰蛋白酶肽段和该蛋白的其他肽段间相关性相比,图5d),这些都说明常规蛋白质组学实验中对蛋白质的定量应该排除半胰蛋白酶肽段。
图6 | 蛋白质降解特征
实验结论
1) 文章揭示了临床组织标本中蛋白质的稳定性,并表明了基于质谱的蛋白质组学结果在临床研究中的可靠性。虽然存在蛋白质降解,但受影响的蛋白质数量有限,且发生降解的样品较少。
2) 蛋白质降解相对独立于mRNA降解。
3)开发了PIN算法用于评估蛋白降解,该算法尤其适用于SWATH / DIA数据,因为该类非数据依赖型质谱采集方法,会以无偏的方式数字记录包括潜在降解产物在内的完整蛋白质组谱图。
小鹿推荐
临床组织中生物分子的降解是不可避免的过程,其可能对分子测量和实验结果产生影响。本文通过RNA-Seq和质谱SWATH技术研究68对前列腺癌患者组织样品中mRNA和蛋白质的降解。为了客观地量化蛋白质降解的程度,作者开发了蛋白质组完整性数字(Proteome Integrity Number, PIN),可有效的测量蛋白质降解的程度。本文结果表明,蛋白质降解仅影响5.9%的测试样品,并且与邻近样品中的mRNA降解显示出可忽略的相关性。这些发现通过对其他临床样本和不同质谱方法的独立分析得到证实。总体而言,结果表明大多数测试样本不会受到蛋白质降解的影响,且PIN评分可成为蛋白质组学分析中评估样本质量的通用和准确的指标。本研究中所用的SWATH技术和DIA技术均为非数据依赖型采集技术(区别在于所用质谱仪器生产公司不同),该类技术定量精确、重现性好且适用于大规模临床样本检测,本文对SWATH技术的应用思路及其开发的评估蛋白降解指标PIN值得借鉴使用。
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